昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗的研究進(jìn)展

李晶梅，靖志強(qiáng)，秦紅剛，薛 霜，漆世華，謝紅玲，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

流感病毒是一種造成人類及動物流行性感冒的RNA病毒，分為A、B、C三型。禽流感病毒屬A型流感病毒，主要感染禽類，每年造成養(yǎng)禽業(yè)巨大損失。1997年首次證實了禽流感病毒可以直接從禽傳播到人[1]，此后又有多起人接觸發(fā)病禽類感染禽流感、發(fā)病死亡的報道。禽流感突破種間屏障對人類易感以及2009年墨西哥豬流感爆發(fā)，都使得流感再次成為人們關(guān)注的焦點。預(yù)防接種疫苗是防控季節(jié)性流感和大流行流感的首選辦法。目前臨床應(yīng)用的流感疫苗以雞胚苗為主，但雞胚苗的生產(chǎn)有諸多限制因素，人們一直試圖開發(fā)新型流感疫苗，以昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus expression vector system，BEVS)表達(dá)流感病毒樣顆粒為核心技術(shù)的新型流感疫苗已成為國內(nèi)外研發(fā)熱點。

1 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)流感病毒樣顆粒

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的由某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于病毒粒子的空心蛋白顆粒。VLPs不含病毒核酸，不能自行復(fù)制，但作為抗原，以病毒感染一樣的途徑遞送給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。流感病毒VLPs是由流感病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞膜上相互作用出芽形成的。因此，流感病毒VLPs為胞外表達(dá)，其研究焦點也集中在基質(zhì)蛋白M1，以及血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和基質(zhì)蛋白M2三種跨膜蛋白上。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種能夠高效表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體系統(tǒng)。桿狀病毒基因組較大，可容納大片段外源基因，且具有多個天然啟動子，也易于構(gòu)建新的人工啟動子，實現(xiàn)多基因表達(dá)，因此可同時插入多個外源基因表達(dá)VLPs。很多研究機(jī)構(gòu)均利用BEVS成功表達(dá)了VLPs，如猴或人的免疫缺陷綜合癥病毒VLPs[2-3]、人乳頭狀瘤病毒 VLPs[4]、肝炎病毒 VLPs[5]、輪狀病毒 VLPs[6]、埃博拉病毒VLPs[7]等。目前，采用BEVS組裝流感病毒VLPs主要有兩種方法:一種是分別構(gòu)建含1～2個流感結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組桿狀病毒，將含不同流感結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組桿狀病毒共感染到同一宿主細(xì)胞組裝成VLPs[8-11];另一種是將多種結(jié)構(gòu)蛋白的基因插入到同一桿狀病毒，感染宿主細(xì)胞組裝成 VLPs。HA、NA、M1、M2 四種結(jié)構(gòu)基因[12-13]或 HA、NA、M1 三種結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建到一個桿狀病毒結(jié)構(gòu)內(nèi)[14-16]，表達(dá)流感病毒VLPs都獲得了成功。電鏡下，表達(dá)的流感病毒VLPs與流感病毒粒子大小相當(dāng)、形態(tài)學(xué)相近，并有流感HA蛋白的典型突起[10，12，16]。

2 BEVS制備的流感病毒VLPs疫苗

BEVS表達(dá)流感病毒VLPs，多以疫苗研發(fā)為目的。構(gòu)建的流感病毒VLPs是否具有良好免疫活性是研發(fā)中關(guān)注的焦點。VLPs單價疫苗、多價疫苗免疫原性研究顯示，流感病毒VLPs與流感全病毒免疫原性相近，高于重組 HA的免疫原性[11，12，14，17-19]。也有研究稱其制備的三價 VLPs 疫苗比三價全病毒滅活疫苗介導(dǎo)了更高的血凝抑制(HAI)抗體，并具有更廣泛的交叉保護(hù)[20]。所以從免疫原性因素考慮，VLPs可以用于制備流感疫苗。

流感病毒VLPs是否適合做疫苗的抗原，還需要從不同方面進(jìn)行考察，科研人員根據(jù)不同的側(cè)重點設(shè)計了各自的實驗。

2.1 交叉免疫保護(hù)效果 能產(chǎn)生廣泛的交叉保護(hù)是優(yōu)質(zhì)疫苗的特性，而流感病毒VLPs是可以具備這種優(yōu)勢的?；谇菰碒5N1流感病毒構(gòu)建的VLPs，以鼠為動物模型，能夠激發(fā)有效的抗體應(yīng)答，保護(hù)同源禽H5N1流感病毒和異源人H5N1流感病毒的攻擊[21]。H1N1流感病毒VLPs免疫組雪貂攻擊H5N1流感病毒，雪貂發(fā)病，但最終全部存活，而對照組雪貂全部死亡[15]，這說明流感病毒VLPs甚至對不同亞型流感病毒也有一定的保護(hù)效果。綜合來說，流感病毒VLPs對同源毒株保護(hù)效果良好，對同亞型不同分支的流感病毒有的能夠保護(hù)、有的則保護(hù)效果不佳[9，18]，對不同亞型的流感病毒無保護(hù)效果或有微弱效果。

2.2 免疫劑量 流感病毒VLPs的免疫效果與免疫的 VLPs的劑量相關(guān)，高劑量 VLPs比低劑量VLPs介導(dǎo)了更高的針對HA的IgG抗體[14]和HAI抗體[22]，攻毒后實驗動物鼻腔病毒載量更低[20]。當(dāng)達(dá)到一定量后，再提高VLPs的劑量，不會再有免疫保護(hù)效果的提升。

2.3 接種方式 接種方式研究集中在鼻腔接種和肌肉注射接種兩種免疫方式。不同研究機(jī)構(gòu)、不同毒株、不同衡量指標(biāo)得到了相同的結(jié)論，即鼻腔接種優(yōu)于肌肉注射接種[15，23]。

2.4 一次免疫和加強(qiáng)免疫 一次免疫和加強(qiáng)免疫相比較，加強(qiáng)免疫的動物免疫保護(hù)效果更好，攻毒后體重數(shù)據(jù)優(yōu)于一次免疫[10，17]。也有研究顯示，一免后僅部分實驗動物有HAI抗體，二免后全部有HAI抗體[20]。此類加強(qiáng)免疫的相關(guān)研究會為制定疫苗免疫程序提供依據(jù)。

2.5 免疫持續(xù)期 流感病毒VLPs能夠引發(fā)長效保護(hù)，二免后28周特異性抗體水平未改變，二免后30周的小鼠能夠抵御同源H5N1亞型高致病性禽流感的攻擊[24]。免疫A/PR8 H1N1流感病毒VLPs的小鼠，也在14周后完全抵御A/PR8流感病毒型的致死性感染[19]。在動物上進(jìn)行的免疫持續(xù)期的研究得到了理想的數(shù)據(jù)，但還需要臨床實驗數(shù)據(jù)才能最終確定VLPs疫苗能夠提供有效保護(hù)的時長。

2.6 多價疫苗與單價疫苗 使用多價疫苗是拓寬保護(hù)范圍的最好辦法。分別表達(dá)不同亞型的流感病毒VLPs制備多價疫苗，動物實驗證明多價疫苗的保護(hù)效果與單價疫苗的效果相當(dāng)。VLPs制備多價疫苗能夠引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，針對的是同亞型的同源株和遺傳關(guān)系相近的毒株[19-20]，并且各抗原不相互拮抗。

2.7 佐劑 有研究顯示，免疫純品VLPs即可有很好的保護(hù)效果。盡管如此，各研究機(jī)構(gòu)仍致力于佐劑的研究，選用了不同的佐劑意圖提升流感病毒VLPs的免疫效果或節(jié)約抗原。研究顯示，添加白細(xì)胞介素-12、胞苷酸鳥苷寡脫氧核苷酸(CpG ODN)、非磷脂脂質(zhì)體納米佐劑(Novasome)的流感病毒VLPs與PBS稀釋的流感病毒VLPs相比較，有更好的免疫效果[8，13，22]。

綜上所述，不同研究機(jī)構(gòu)圍繞流感病毒VLPs是否具有制備流感疫苗的特質(zhì)，做了大量開發(fā)流感病毒VLPs疫苗所需的臨床前研究工作。他們都構(gòu)建出了有很好的免疫原性流感病毒 VLPs，如H1N1、H3N2、H9N2、H5N1亞型和 B 型流感病毒的VLPs。雖然亞型、毒株、構(gòu)建方法不盡相同，但都得到了相同的結(jié)論，即含有流感主要保護(hù)性蛋白(HA和NA)的VLPs展現(xiàn)了流感病毒的功能特性，以其作為抗原制備疫苗免疫動物，攻毒后抵御流感病毒的攻擊、抑制流感病毒復(fù)制。

3 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備流感病毒VLPs疫苗的優(yōu)勢和應(yīng)用前景

3.1 流感病毒VLPs疫苗的優(yōu)勢和風(fēng)險 與雞胚生產(chǎn)流感病毒相比，BEVS生產(chǎn)抗原有明顯優(yōu)勢。在具有大體積生物反應(yīng)器技術(shù)、規(guī)模化培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞制備抗原、保證產(chǎn)量的同時，產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性也得到保障，并且降低了人力成本;禽流感爆發(fā)流行會限制原材料雞胚的供應(yīng)，使疫苗生產(chǎn)無法供應(yīng)市場，而細(xì)胞放大用于生產(chǎn)，疫苗供應(yīng)不會中斷，并且細(xì)胞培養(yǎng)無廢物處理環(huán)節(jié);不涉及活的流感病毒，無生物安全方面隱患;VLPs自我組裝后的宏觀結(jié)構(gòu)所展現(xiàn)的是天然的構(gòu)象決定簇，對于免疫系統(tǒng)而言，可以和活病毒粒子相媲美[25]。

原材料成本方面，雞胚生產(chǎn)流感病毒使用無特定病原體(SPF)雞胚做原材料，每枚SPF雞胚6～8元，抗原產(chǎn)量8～12 mL，還需核算運輸成本和孵化損失，最終每毫升抗原折合原材料成本1元左右;市售昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液價格很高，工業(yè)化生產(chǎn)可以直接從培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家訂購昆蟲細(xì)胞干粉培養(yǎng)基，10 L裝量的干粉培養(yǎng)基價格2000～3000元，最終每毫升抗原折合原材料成本0.2～0.3元。所以與雞胚生產(chǎn)流感病毒相比，BEVS生產(chǎn)抗原也有價格優(yōu)勢。

利用BEVS研發(fā)流感疫苗也有一定技術(shù)風(fēng)險:大體積生物反應(yīng)器培養(yǎng)昆蟲桿狀病毒，前期設(shè)備投入大，操作維護(hù)技術(shù)含量高，以高抗原產(chǎn)量為目的的生產(chǎn)工藝摸索也有很大不確定性。

3.2 在人用疫苗的應(yīng)用前景 歐洲藥品審評署(EMEA)和美國食品藥物管理局(FDA)先后允許由BEVS生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒VLPs疫苗在人類使用[26-27]，說明 BEVS生產(chǎn)的疫苗，用于人類是受到認(rèn)可的。表達(dá)流感病毒VLPs的重組桿狀病毒的構(gòu)建技術(shù)非常成熟，有很多成功經(jīng)驗。從分離出突變株的結(jié)構(gòu)蛋白基因到疫苗產(chǎn)品一般需十幾周時間，疫苗上游研發(fā)耗時短，能夠應(yīng)對流感的快速、多突變特性，并且重組昆蟲桿狀病毒合成后，VLPs的生產(chǎn)過程少于1周時間。純化質(zhì)控工藝可以參考現(xiàn)用流感疫苗，通過密度梯度離心和離子交換層析，獲得VLPs純品。純化的VLPs采用SDS-PAGE光密度掃描法定量，也可以利用粒子構(gòu)成和血凝分析。

Novavax公司研發(fā)的流行性感冒病毒VLPs疫苗正在做一期臨床，其三聯(lián)季節(jié)性流感病毒VLPs疫苗已進(jìn)入二期臨床。已公布的結(jié)果顯示，兩種疫苗保證安全性的同時都有較好的免疫原性。

3.3 在獸用疫苗的應(yīng)用前景 禽流感疫苗在獸用疫苗中占有重要份額，是養(yǎng)禽業(yè)疫病防控必不可少的疫苗之一。目前，獸用禽流感疫苗為反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的疫苗株生產(chǎn)的全病毒滅活疫苗，也是以雞胚作為生產(chǎn)原料，無需抗原精細(xì)提純，只經(jīng)過簡單濃縮純化制備的油包水型疫苗。傳統(tǒng)雞胚疫苗經(jīng)市場多年驗證，效果確實。核酸疫苗、活病毒載體疫苗、全病毒細(xì)胞苗的研究與開發(fā)都在火熱進(jìn)行。獸用流感病毒VLPs疫苗要在激烈的市場競爭中獲得認(rèn)可，前期的研發(fā)工作至關(guān)重要。

未經(jīng)純化的流感病毒VLPs包含有非流感的可溶性蛋白，對致死性攻擊也起到100%的保護(hù)，不過比純化的流感病毒VLPs的免疫保護(hù)效果差，體現(xiàn)在實驗動物短期體重流失[28]。另外，未經(jīng)純化的流感病毒VLPs培養(yǎng)液上清內(nèi)含桿狀病毒，不適宜在純度要求高的人用疫苗使用，在實際應(yīng)用中，可以考慮將經(jīng)簡單濃縮純化的流感病毒VLPs用于制備獸用滅活疫苗。目前來看，流感病毒VLPs用于獸用疫苗的相關(guān)研究并不是很多。H5N3亞型禽流感病毒VLPs在鴨的研究和H9N2亞型禽流感病毒VLPs在SPF雞的研究顯示，VLPs疫苗在禽類有很好的免疫保護(hù)效果，有希望被開發(fā)成為新一代禽用疫苗[29-30]。再者，VLPs疫苗不包含核衣殼蛋白(NP)，ELISA檢測NP抗體可以區(qū)分疫苗免疫動物和自然感染動物，使淘汰撲殺病禽成為可能，有利于養(yǎng)殖場禽流感的凈化。

與人用疫苗研發(fā)不同，獸用疫苗研發(fā)使用本動物做安全性評估和免疫效力評估，評估方法成熟，實驗結(jié)果認(rèn)可度高。獸用疫苗特性和動物實驗的優(yōu)勢，使得獸用流感病毒VLPs疫苗研發(fā)和生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于人用流感病毒VLPs疫苗。

4 總結(jié)

目前，已有多家研究機(jī)構(gòu)和商業(yè)公司對BEVS制備的流感病毒VLPs疫苗做了較全面而系統(tǒng)的研究。雖然有各種原理和技術(shù)細(xì)節(jié)有待研究和解決，但此類疫苗仍是備受期待的防控流感的有效疫苗?；谇萘鞲胁《綱LPs獸用疫苗的研究報道甚少，有必要像人用疫苗一樣著手重點研究獸用禽流感病毒VLPs疫苗，從而為未來可能出現(xiàn)的禽流感新疫情提早準(zhǔn)備對策。

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