雞傳染性貧血病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，沈志強(qiáng)

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130062）

雞傳染性貧血（chicken infectious anemia，CIA）是由雞傳染性貧血病毒（chicken anemia virus，CAV）引發(fā)，自1979年日本學(xué)者Yuasa等［1］分離到了雞傳染性貧血病毒以來，英國(guó)、德國(guó)、澳大利亞、美國(guó)等世界許多國(guó)家相繼證明了該病毒的存在，我國(guó)亦于1992年由崔現(xiàn)蘭等［2］分離到CAV。CAV在1995年的第6次國(guó)際病毒分類委員會(huì)維也納會(huì)議報(bào)告中被歸為圓環(huán)病毒科（circoviridae），環(huán)狀病毒屬［3］。游離CAV為DNA病毒，球形，直徑約23～25nm，無囊膜，二十面體對(duì)稱，是目前已知的最小病毒之一。CIA以引起雛雞再生障礙性貧血和免疫抑制為主要特征，嚴(yán)重影響雛雞生長(zhǎng)發(fā)育和免疫反應(yīng)，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原之一。該病對(duì)雛雞和肉雞威脅很大，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)可觀，而且它還可與其他免疫抑制性傳染因子（包括馬立克病、傳染性腔上囊病等免疫抑制性疾病病毒）相互作用，所造成的損失往往更大。CAV在雞群中廣泛存在，成雞感染CAV后呈亞臨床帶毒狀態(tài)，易被忽視，是養(yǎng)雞業(yè)上潛藏的巨大威脅。因此對(duì)本病的防制越來越引起國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)工作者和養(yǎng)禽界的高度重視，并被列為禽病研究的前沿課題。對(duì)CAV的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多，本文對(duì)該病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要概述。

1 病毒分離鑒定

肌肉注射或腹腔內(nèi)接種1日齡SPF雛雞是初次分離CAV最特異、可靠的動(dòng)物試驗(yàn)方法。試驗(yàn)證明1日齡雛雞接種感染CAV后7d病毒滴度達(dá)最高，其中胸腺內(nèi)病毒含量高于肝臟和骨髓，因此在所有的病雞組織中，以胸腺作為病毒分離材料最好，其辦法是在雞發(fā)病后7d采取胸腺，以Eagle液制成20%乳劑，反復(fù)凍融3次，加等量氯仿混合或70℃感作5min，去掉或滅活可能的污染物，2 500 r／min離心10min后，取上清液作為病毒分離材料。接種14～16d后對(duì)感染雛雞做貧血癥狀檢查，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞比容（HCT）低于27%，剖檢可見特征性骨髓黃化、胸腺萎縮、肌肉皮下出血及其他貧血癥狀，可初步診斷為CIA陽性。有些HCT值不是很低的雞也可出現(xiàn)典型的肉眼可見病變，也將其判為CIA陽性。

體外分離病毒，目前普遍使用MDCC－MSBl傳代細(xì)胞做體外培養(yǎng)。接種細(xì)胞的初始濃度為（2～3）×105個(gè)／mL，接種劑量一般為1∶10體積分?jǐn)?shù)，感染的細(xì)胞每隔2～4d繼代1次。經(jīng)過1～6次帶毒繼代，可見感染細(xì)胞腫脹、邊緣破裂，死亡細(xì)胞逐漸增多，直至最后CAV感染細(xì)胞大部分死亡，培養(yǎng)液顏色不再發(fā)生改變，細(xì)胞不能繼續(xù)傳代。細(xì)胞不能再繼續(xù)傳代者判為分離陽性，一般規(guī)定傳7代，以決定材料中有無CAV存在［4］。

2 血清學(xué)診斷

2.1 病毒中和試驗(yàn)（NT） 中和試驗(yàn)既可用雞，又可用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行，該法敏感性很高，但需要3～4周方能完成。用雛雞作中和試驗(yàn)時(shí)，用1日齡SPF雞進(jìn)行，將血清5倍稀釋后在56℃滅活30min，與等體積量2×103CID50（可使50%雛雞發(fā)病的有效劑量）的CAV混合后37℃作用1h或4℃過夜，接種5只1日齡SPF易感染雞，每只0.3mL，接種后觀察16d，有3只接種雞發(fā)病判為抗體陽性，2只或1只接種雞發(fā)病判為疑似，全部發(fā)病判為血清抗體陰性。以培養(yǎng)細(xì)胞作中和試驗(yàn)時(shí)，用經(jīng)MDCC－MS－Bl細(xì)胞增殖的CAV為種毒，滴度約為106TCID50／0.1mL。將滅活的待檢血清作1∶5稀釋，再進(jìn)行2倍倍比稀釋，與等量含200TCID50／0.1mL的CAV培養(yǎng)液混合，把混合液放入37℃作用1h或4℃過夜，取0.1mL混合液接種1mL MSBl細(xì)胞培養(yǎng)物中滴定。每個(gè)稀釋度至少要接種2孔（管）。感染細(xì)胞以1∶5繼代，需經(jīng)過7次，根據(jù)繼代細(xì)胞是否死亡做出判定。血清抗體中和效價(jià)以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。

2.2 免疫熒光試驗(yàn)（FA） 熒光抗體試驗(yàn)既可檢測(cè)CAV抗原，又可檢測(cè)抗體，均用CAV感染MDCCMSBl細(xì)胞進(jìn)行。該方法符合率極高，使用較多。具體方法是在開始出現(xiàn)細(xì)胞溶解之前收集以CAV感染的MDCC－MSBl細(xì)胞，這個(gè)時(shí)間通常在接種后36～42h，收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，風(fēng)干后用丙酮固定后用作抗原。感染的細(xì)胞首先與適當(dāng)稀釋的待檢血清反應(yīng)，然后用熒光素標(biāo)記的抗雞IgG哺乳動(dòng)物抗血清作用，用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，當(dāng)鏡檢細(xì)胞核內(nèi)有大小不等的黃綠色熒光染色顆粒，就可以認(rèn)為待檢血清中有抗體。胡清海等（2001）［5］研究建立的間接免疫熒光抗體（IIFA）方法，一方面可以監(jiān)測(cè)雞群的CAV抗體，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及篩選試驗(yàn)用的陰性雞群，另一方面可檢測(cè)CAV基因工程亞單位免疫后雞體內(nèi)的CAV抗體水平變化。在檢測(cè)雞血清中低濃度的CAV抗體方面，間接FA試驗(yàn)的敏感性不如NT試驗(yàn)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 目前已經(jīng)建立了各種ELISA法用于檢測(cè)和定量雞血清中CAV抗體。王英等（2005）［6］用大腸桿菌表達(dá)的CAV部分VP1蛋白作為包被抗原，建立了CIA間接ELISA診斷方法，確定了抗原最適包被濃度為5 μg／mL，血清最適稀釋度為1∶100，其作用時(shí)間為60min，酶標(biāo)抗體最適作用時(shí)間為60min，S／P≥0.24為陽性，S／P≤0.19為陰性，介于二者之間為可疑的判定標(biāo)準(zhǔn)。該抗原不與雞其他疾病的10種陽性血清反應(yīng)，具有良好的特異性；批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)小于10%，批間重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)小于15%，具有良好的重復(fù)性；該方法可檢出人工接毒后20d的血清抗體，直到試驗(yàn)結(jié)束110d時(shí)，仍能檢出雞血清陽性率為81%與全病毒包被抗原ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)92%以上，與進(jìn)口診斷試劑盒的符合率為97%，為免疫雞群抗體檢測(cè)和進(jìn)行CIA流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。

2.4 免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金快速診斷技術(shù)是20世紀(jì)80年代在免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的一種新型獨(dú)特的診斷技術(shù)。孫素玲（2008）［7］對(duì)15周齡SPF雞進(jìn)行4次免疫后，制備CIA血清抗體并對(duì)其進(jìn)行純化，測(cè)定CAV抗原最佳包被濃度和血清的最佳稀釋度，研究純化后血清抗體的蛋白含量和效價(jià)。該研究為制備CIA膠體金快速診斷試紙條奠定了基礎(chǔ)。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè) 2000年宋秀龍等［8］首次在國(guó)內(nèi)建立了CAV的套式PCR檢測(cè)方法，該方法具有高度的特異性和敏感性，已成功應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。徐福洲等（2004）［9］應(yīng)用PCR和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)試驗(yàn)感染雛雞體內(nèi)CAV的動(dòng)態(tài)分布，兩種檢測(cè)方法均顯示免疫器官是CAV的主要靶器官、胸腺和脾臟在各種組織中檢出率最高，是臨床檢測(cè)中的首選樣品。鄧顯文等（2009）［10］根據(jù)CAV的VP1、VP2基因序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，建立了檢測(cè)鑒別CAV的PCR技術(shù)，并研制出CAV－PCR檢測(cè)試劑盒。該試劑盒具有特異、敏感、快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適合在臨床生產(chǎn)中推廣使用。宋修慶等（2009）［11］根據(jù)CAV的基因序列，選取一段高度保守的基因序列作為目的片段設(shè)計(jì)引物與探針，將該目的片段克隆到pMD18－T載體中，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。通過優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)條件，建立了CAV的熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的敏感性達(dá)到10個(gè)病毒拷貝／μL，與其他禽病病毒無交叉反應(yīng)，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)相關(guān)系數(shù)都小于5%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，該檢測(cè)方法敏感性高，特異性好，重復(fù)性佳。張?zhí)璧龋?009）［12］建立了Taq man實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)CAV，該方法靈敏度高，特異性好，可以進(jìn)行定量分析，在禽病的快速檢測(cè)上具有重要意義。

3.2 核酸探針檢測(cè)法 Allan 等（1993）［13］利用PCR制備的生物素化DNA探針作原位雜交，可以檢測(cè)福爾馬林、石蠟包埋的胸腺切片中的CAV。劉岳龍等（1996）［14］報(bào)道的核酸探針檢測(cè)法可從臨床病料中檢測(cè)CAV，用于大批田間樣品作CAV帶毒檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。吉榮等（2001）［15］用digoxigenin標(biāo)記的CAV和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）核酸探針以及PCR技術(shù)對(duì)某種雞場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。姜世金等（2003）［16］用斑點(diǎn)雜交法同時(shí)檢測(cè)雞群中的CAV、雞馬立克氏病病毒（MDV）和REV。顏赟等（2010）［17］應(yīng)用特異性核酸探針技術(shù)對(duì)來自山東省肉種雞群采集102份有腫瘤病變的病、死雞肝臟樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，MDV、REV、CAV的檢出率分別為88.24%、79.41%、47.06%，且存在嚴(yán)重的共感染現(xiàn)象。孟斌等（2010）［18］采用地高辛標(biāo)記的核酸探針－斑點(diǎn)雜交法對(duì)淘汰的商品肉雞、病死商品肉雞及淘汰肉種雞進(jìn)行了 MDV、CAV、REV和禽呼腸孤病毒（ARV）4種病毒病原的檢測(cè)。

3.3 競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測(cè)法 日本學(xué)者山口成夫等（2000）［19］用缺失一段核苷酸序列的CAV DNA通過PCR擴(kuò)增，分子克隆，構(gòu)建成了競(jìng)爭(zhēng)性模板，然后將競(jìng)爭(zhēng)性模板DNA、樣品DNA和PCR反應(yīng)試劑一起加入到反應(yīng)管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物量即可得出樣品DNA含量，從而檢測(cè)出樣品中的CAV含量。這種方法不但特異性強(qiáng)，而且敏感性高，較傳統(tǒng)的血清中和反應(yīng)作定量檢測(cè)大大節(jié)約時(shí)間和成本，因此該方法常用于分析病毒的定量和病毒在體內(nèi)的分布等。劉澤文等（2005）［20］將刪除33個(gè)堿基序列的CAV DNA 克隆進(jìn)質(zhì)粒pSBII，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)過純化、定量后作為競(jìng)爭(zhēng)性模板，建立了一種定量檢測(cè)CAV核酸方法。該方法能夠檢測(cè)出的最低CAV DNA為103.5Molecules／μL，其精確度可達(dá)到100.5Molecules／μL。該方法與傳統(tǒng)方法相比，具有節(jié)省時(shí)間、節(jié)約試劑和受其他因素干擾小等特點(diǎn)。

4 結(jié)論

CAV是一種特殊的病毒，具備一些常見動(dòng)物病毒所沒有的特性，可以發(fā)展成為一個(gè)研究動(dòng)物病毒與宿主之間相互關(guān)系的理想模型，尤其是非編碼區(qū)的特征性調(diào)控元件，如重復(fù)序列和淋巴組織特異的轉(zhuǎn)錄因子值得深入研究。目前國(guó)際上有兩種商品化活疫苗可供免疫：一種是通過雞胚增殖的有毒力CAV活疫苗和MSB1細(xì)胞中增殖的外源性病原活病毒。此類活病毒苗必須在開產(chǎn)前5周以上使用，以免垂直傳播。第二種是通過長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)傳代致弱的CAV弱化毒接種母雞。盡管這兩種疫苗免疫雞后可產(chǎn)生良好的保護(hù)作用，但是都有亞臨床癥狀產(chǎn)生，許多國(guó)家或地區(qū)不允許使用。在國(guó)內(nèi)尚未研制出理想的疫苗用于預(yù)防雞傳染性貧血，對(duì)其防制仍采取一般性綜合防制措施。因此，迫切需要研究可以準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)CAV病原的診斷方法和高效的疫苗。病毒分離、血清學(xué)方法、PCR及核酸探針等技術(shù)的成功應(yīng)用于CAV檢測(cè)，開辟了CAV檢測(cè)技術(shù)的新途徑，隨著新技術(shù)的不斷發(fā)展，相信會(huì)有更多、更好的CAV檢測(cè)新方法出現(xiàn)。

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