死亡番鴨胚中綠膿桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

陳紅梅，程龍飛，萬春和，施少華，傅光華，黃 瑜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州350013）

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）也稱銅綠假單胞菌，是假單胞菌屬的代表菌種，是具有莢膜、鞭毛和無芽孢的革蘭陰性桿菌。該菌廣泛分布于自然界，對環(huán)境抵抗力較強，是常見的條件致病菌之一。隨著家禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷規(guī)模化發(fā)展，綠膿桿菌感染家禽變得越來越常見，對養(yǎng)殖業(yè)造成一定的損失。近年來，本病在遼寧、北京、天津、河北、四川和福建等地均有發(fā)生，其主要原因是注射污染、環(huán)境惡劣、營養(yǎng)不良、運輸?shù)葢?yīng)激因素［1］。在關(guān)于綠膿桿菌致死胚的報道中，最常見的是對雞胚的侵害［2－4］，其次是對鵝胚［5］，但目前對番鴨胚的侵害未見報道。

2010年以來，福建某大型番鴨孵化場自番鴨胚入孵后不時出現(xiàn)死亡，死亡率約為10%。為了尋找番鴨胚死亡原因，筆者對送診的死亡番鴨胚進行病原學(xué)檢測和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 病料樣品來源于福建省某大型番鴨孵化場的死亡番鴨胚20枚。

1.2 主要試劑 血瓊脂平板，購自O(shè)XOID公司；細菌生化反應(yīng)管與藥敏試紙，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；其他試劑均為分析純；普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板以及普通肉湯自制。

1.3 試驗胚與試驗動物 試驗胚來自某孵化場的10日齡番鴨胚，試驗動物為購置健康鴨場7日齡的雛番鴨。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)與純化 無菌條件下取死亡番鴨胚的尿囊液，適當稀釋后分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h后取出，挑取其中單一的菌落進行純化，再將純化后的菌落于普通肉湯中37℃、150 r／min進行振蕩培養(yǎng)。普通營養(yǎng)瓊脂平板置4℃繼續(xù)觀察。

1.5 病毒的分離 將死亡番鴨胚的尿囊液反復(fù)凍融3次后，8 000r／min離心5min，取上清，用0.22 μm的濾膜過濾，濾過液接種2枚10日齡番鴨胚，每枚0.2mL，37℃孵化，每天觀察2次，連續(xù)觀察7d，另設(shè)空白對照。接著收取第一代的尿囊液，并將此尿囊液盲傳3代。

1.6 革蘭染色鏡檢 采用常規(guī)方法進行革蘭染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.7 生化試驗 挑取純培養(yǎng)的單菌落接種細菌生化微量鑒定管，37℃培養(yǎng)24h觀察生化試驗結(jié)果。

1.8 藥敏試驗 采用紙片擴散法，檢測分離菌株對18種常用抗菌藥物的敏感性。判斷標準參照中國藥檢所制定的標準。

1.9 動物回歸試驗

1.9.1 番鴨胚的接種 取分離菌肉湯培養(yǎng)液經(jīng)尿囊腔接種10枚番鴨胚，每枚接種0.2mL（108CFU／mL），同時設(shè)立對照番鴨胚5枚，每枚接種生理鹽水0.2mL。將15枚番鴨胚置37℃溫箱中直立孵化，每天觀察3次并記錄胚胎存活情況，連續(xù)觀察3天。番鴨胚死亡后剖檢觀察記錄其病理變化，同時無菌操作將尿囊液接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板分離培養(yǎng)菌 。

1.9.2 雛番鴨的接種 取分離菌肉湯培養(yǎng)液，肌肉注射健康7日齡的雛番鴨15只，每只0.2mL（108CFU／mL）。同時設(shè)立對照雛番鴨5只，每只肌肉注射生理鹽水0.2mL。每天觀察2次并記錄其發(fā)病情況。雛番鴨發(fā)病死亡后剖檢觀察，記錄其病理變化，同時無菌操作將肝臟接種普通營養(yǎng)瓊脂平板分離培養(yǎng)菌。

2 結(jié)果

2.1 病原分離與培養(yǎng)特性觀察

2.1.1 細菌分離 根據(jù)普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血瓊脂平板上菌落生長情況，篩選出1株優(yōu)勢菌，該優(yōu)勢菌在普通營養(yǎng)瓊脂上生長為微隆起、光滑、濕潤、半透明、邊緣不整齊（試管刷狀）的中等大小的菌落，數(shù)日后觀察，發(fā)現(xiàn)菌落及整個培養(yǎng)基均呈綠色；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成無色、半透明的圓形菌落；而在血液瓊脂培養(yǎng)基上長出灰色、邊緣不整齊的較大菌落，能形成β溶血環(huán)。普通肉湯呈綠色、混濁，表面有菌膜。鏡檢結(jié)果是兩端鈍圓、長短不一的革蘭陰性的細長桿菌。

2.1.2 病毒分離 盲傳三代后，未見番鴨胚死亡，可見送檢的死亡番鴨胚無病毒感染。

2.2 生化試驗 由表1可知，所分離的細菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、菊糖、木糖、阿拉伯糖、衛(wèi)矛醇、半乳糖、果糖、棉子糖；不產(chǎn)生H2S，能還原硝酸鹽，M.R.試驗和VP試驗均為陰性。生化試驗結(jié)果與綠膿桿菌生化特性相符。

表1 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 藥敏試驗 藥敏結(jié)果（表2）顯示，該分離菌對環(huán)丙沙星高敏；對丁胺卡那霉素、多黏菌素、鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星中敏：對氨芐青霉素、阿莫西林、紅霉素和壯觀霉素等低敏。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

2.4 動物回歸試驗

2.4.1 番鴨胚的接種結(jié)果 試驗組接種48h后的番鴨胚全部死亡，胚體水腫，出血，并從死亡番鴨胚的尿囊液中重新分到綠膿桿菌。對照組的番鴨胚孵化良好。

2.4.2 雛番鴨的接種結(jié)果 試驗組接種24h后雛番鴨開始出現(xiàn)死亡，到48h內(nèi)雛番鴨全部死亡，對照組雛番鴨健康。剖檢死亡雛番鴨，可見肝淤血和胰腺出血，并從死亡雛番鴨的肝臟中重新分離到該菌。

3 討論與小結(jié)

3.1 本試驗從死亡番鴨胚中分離了1株細菌，通過對分離細菌的染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗，以及動物回歸試驗的結(jié)果，確定福建某大型番鴨孵化場番鴨胚死亡的原因為綠膿桿菌感染引起。

3.2 綠膿桿菌普遍存在耐藥性，應(yīng)當參照藥敏試驗的結(jié)果選擇敏感的藥物，使用敏感的藥物進行對癥治療，最大限度地減少養(yǎng)殖戶的損失。本試驗所分離的綠膿桿菌對環(huán)丙沙星高度敏感；對丁胺卡那霉素、多黏菌素、鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星中度敏感；與目前使用頻率比較高的藥物如慶大霉素、新霉素和環(huán)丙沙星等較為相近。

3.3 綠膿桿菌是條件致病菌，廣泛存在于水、土壤、空氣和動物的腸道和皮膚中。引起該菌污染胚蛋的原因已經(jīng)很明確，有以下幾個方面：第一，種禽的羽毛、糞便等污染了蛋殼；第二，胚蛋出現(xiàn)破蛋、裂紋蛋及薄殼蛋，這給綠膿桿菌的入侵提供條件；第三，種蛋在孵化過程中，對孵化室沒有執(zhí)行嚴格的消毒制度，很容易引起綠膿桿菌的污染，而造成種蛋的死亡，甚至引起弱雛出殼后死亡［2－8］。

3.4 對于預(yù)防綠膿桿菌污染胚蛋的措施，要做好以下兩點：首先嚴格挑選種蛋并做好種蛋的消毒，從源頭上杜絕該菌的污染；其次要嚴格執(zhí)行孵化室的消毒制度。一旦發(fā)生綠膿桿菌感染胚蛋，要盡快使用敏感的藥物對出殼后的幼雛進行補救性治療，將損失降到最低。

［1］邢法祿.鴨銅綠假單胞桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］.中國畜禽種業(yè)，2011，10：126－129.

［2］劉洋，鄭家明，趙輝，等.雞死胚中綠膿桿菌的分離和鑒定［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：14－17.

［3］賀海萍.雞死胚中綠膿桿菌的分離與鑒定［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2009，39（3）：14－15.

［4］盧中華，崔保安，路紅麗，等.孵化廳內(nèi)雞胚與雛雞的沙門氏菌與綠膿桿菌混合感染［J］.河南畜牧獸醫(yī)，1997，18（3）：5－8.

［5］路振香，許大洋.綠膿桿菌致死鵝胚的初步研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37（5）：38－39.

［6］張桂枝，靳雙星，李新正，等.初生雛雞暴發(fā)綠膿桿菌病的診治與原因分析［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2011（2）：35－36.

［7］何虎成，韓慶彥.雛雞綠膿桿菌病診治［J］.甘肅畜收獸醫(yī)，1995，2：18－19.

［8］李翠蓉.初生雛鴨綠膿桿菌感染［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：221－223.