登·革·熱·研·究·進·展

張守平，汪 明

（中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 國家動物原蟲實驗室，北京 海淀 100193）

登革熱是由登革病毒（dengue virus，DENV／DV）引起的人和動物的一類以發(fā)熱，關(guān)節(jié)疼痛，紅疹為特征的蟲媒性疾病，白紋伊蚊和埃及伊蚊是其主要的傳播媒介。病毒感染后可引起登革熱（dengue fever，DF）、登革出血熱（dengue haemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）。登革熱廣泛的流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，近幾十年來，隨著旅游和經(jīng)濟的發(fā)展，登革熱患者不斷增加。據(jù)WHO估計，目前全球2／5的人口受到登革熱感染的威脅，每年約有億計的人感染該病毒。我國廣東，云南，臺灣等省份亦有病例報道出現(xiàn)［1，9］。

1 病原學

1.1 病毒特征和理化特性 DENV屬于黃病毒科黃病毒屬，有囊膜，單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒。病毒粒子直徑約為40～50nm，20面體對稱。病毒基因組長約11kb，共編碼10個蛋白，即3個結(jié)構(gòu)蛋白（C－prM－E），和7個非 結(jié)構(gòu) 蛋白（NS1－NS2A－NS2BNS3－NS4A－NS4B－NS5）。其中E蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，決定著病毒的組織親嗜性，介導病毒與細胞受體的結(jié)合，同時它還是影響病毒毒力，引起保護性免疫反應及免疫病理損傷的重要成分［2］。

病毒對熱敏感，56℃30 min即可以滅活。氯仿、丙酮等脂溶劑、脂酶或去氧膽酸鈉可以通過破壞病毒包膜而滅活病毒。病毒對胃酸、膽汁和蛋白酶均敏感，對紫外線、γ射線亦敏感。酒精、1%碘酊、2%戊二醛、2%～3%過氧化氫、3%～8%甲醛等消毒劑也可以滅活病毒。

1.2 病原分離和培養(yǎng)特性 病毒可由發(fā)熱期患者的血清、血漿或白細胞中分離獲得。也可以從死者的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、腦脊液、腹水中分離獲得。從血液中分離病毒一般應在發(fā)熱期進行，最好是感染的前5d，即在形成中和型抗體之前［3］。

登革病毒可以在多種昆蟲和哺乳動物細胞中培養(yǎng)增殖，并引起培養(yǎng)細胞折光性增強、細胞變圓或細胞融合等不同程度的細胞病變。昆蟲傳代細胞系，如白紋伊蚊C6／36等對登革病毒敏感，可用于病毒分離，也是目前最常用的登革病毒增殖的細胞系。哺乳動物細胞系，如人細胞系、乳地鼠腎細胞（BHK21）、非洲綠猴腎細胞（VERO）、原代狗腎細胞（PDK）等均可用于病毒效價的滴定和疫苗的制備［4］。

1.3 抗原性、血清型 根據(jù)病毒E蛋白抗原性的不同，可以分為4個血清型，即DENV1，DENV2，DENV3，DENV4。各型病毒之間抗原性有交叉，但與黃病毒科的其他抗原群無交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原決定簇既可以誘導宿主產(chǎn)生保護性的中和抗體和血凝抑制抗體，還可能參與登革出血熱（DHF）和登革休克綜合征（DSS）的發(fā)生。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS3均具有免疫反應性和免疫原性，可以誘導小鼠產(chǎn)生針對同型登革病毒的保護性免疫。

2 流行病學

人和靈長類動物是登革病感染的自然宿主，靈長類動物包括黑猩猩、獼猴、長臂猿、恒河猴、狒狒等。東南亞森林中的猴感染后多不發(fā)病，但可成為傳染源。登革病毒的媒介昆蟲是伊蚊屬成員，在登革熱疫區(qū)的主要傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊。這些伊蚊在全世界大多數(shù)地區(qū)存在，當叮咬感染了登革病毒的人或動物時，可以通過改換叮咬對象而直接傳播病毒。目前尚無在人－人之間的傳播。

本病的分布與其媒介伊蚊相一致，廣泛分布于全球的熱帶和亞熱帶的地區(qū)。目前已有一百多個國家報道本病的流行，主要是東南亞、南亞、西太平洋的一些國家和地區(qū)。我國的海南、廣東、廣西、福建、臺灣等沿海地區(qū)是登革熱的流行區(qū)［5］。早在19世紀70年代，我國臺灣就有登革熱發(fā)生的記載［6］。1917年，登革熱從南亞傳入我國大陸，先后在上海、廣東、福建、浙江、江西、湖北及臺灣等省發(fā)生流行。解放后，登革熱得到了良好的控制。在經(jīng)過了30多年后，1978年廣東省佛山市突然發(fā)生了由登革4型引起的登革熱流行。近幾年以來，廣東省幾乎每年均有登革熱病例發(fā)生，波及范圍越來越大，病例數(shù)上升明顯［1，7］。另外，云南，貴州等省也先后從伊蚊中分離到病毒，當?shù)厝巳汉蛣游矬w內(nèi)也檢測到特異性的抗體［8］。北京、上海、香港、澳門等地輸入性病例的報道也都有發(fā)生［9］。有統(tǒng)計表明，從1978年以來，到1998的20年間，總共發(fā)生20次不同程度的流行。報告的病例是越來越多，波及的范圍是愈來愈廣，但大多數(shù)學者認為，目前登革熱在中國并未形成地方性的流行［9］。

由于本病的媒介主要是伊蚊。因此在大多數(shù)地區(qū)，登革熱的流行具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在氣溫高、雨量多的季節(jié)，主要是在5～10月份。一般雨后2～3周伊蟻密度上升，導致發(fā)病高峰出現(xiàn)。雨量增多，溫度升高，可縮短病毒在媒介中的潛伏期。在亞熱帶地區(qū)主要在多雨季節(jié)發(fā)生流行，雨季過后的幾個月，由于干旱，DF的發(fā)病率明顯下降。我國的流行季節(jié)，廣東、廣西為5～10月份，海南為3～10月份［10］。

本病是任何年齡均可發(fā)病，但不同地區(qū)稍有差異，東南亞地區(qū)發(fā)病群多數(shù)為15歲以下兒童，泰國登革出血熱多發(fā)生于5～8歲兒童，古巴的發(fā)病群則多數(shù)為成年人。我國從嬰兒到老人均有發(fā)病，以兒童和青壯年患病率最高，性別無明顯差異。

3 臨床癥狀和發(fā)病機制

3.1 臨床癥狀 登革病毒多引起無癥狀的隱性感染。而發(fā)病患者的主要臨床表現(xiàn)有登革熱（DF）、登革出血熱（DHF）以及登革休克綜合征（DSS）。DF主要臨床表現(xiàn)有突起高熱、嚴重頭痛（大部分是前額痛）、眼后痛（眼球活動時加重）、全身疼痛和關(guān)節(jié)痛，可伴有惡心嘔吐，另外可有淋巴結(jié)腫大、白細胞和血小板減少等癥狀。DF還可引發(fā)心、肝、肺、腎、腦等多系統(tǒng)損害，也可導致心肌損害。DHF／DSS的臨床表現(xiàn)更為嚴重，除了上述DF的癥狀外，可出現(xiàn)嚴重持續(xù)的腹痛，鼻、口腔、牙齦出血，皮膚出血瘀斑，黑色大便，極度口渴，皮膚黏膜蒼白，發(fā)冷，煩躁不安或嗜睡，血細胞比容＞35%等表現(xiàn)，嚴重者可致死亡。DENV感染還可導致腦炎。近幾年DENV感染病例的臨床表現(xiàn)有一些變化，在診斷中應引起注意［8］。

3.2 發(fā)病機制 登革熱和登革出血熱的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明，一般認為是由于病毒和宿主復雜的相互作用引起的，重癥危險因子包括患者年齡、病毒血清型和基因型以及宿主的遺傳背景等。近年的研究認為發(fā)病機制有幾種假說：病毒親嗜性、病毒毒力學說、宿主的易感因素、抗體依賴性感染增強作用（antibody－dependent enhancement，ADE）、交叉反應性T細胞反應及細胞因子風暴（cytokine storm）等［11］，現(xiàn)簡要介紹ADE和細胞因子風暴。

學者認為DENV表面存在群特異性決定簇和型特異性決定簇，前者產(chǎn)生的抗體對DENV感染有較強的增強作用，稱增強型抗體；后者產(chǎn)生的抗體稱中和型抗體。機體二次感染不同型DENV時，血清中中和型抗體不能完全中和病毒，而增強型抗體可以與病毒結(jié)合為免疫復合物，這些免疫復合物通過單核細胞或巨噬細胞膜上的Fc受體，促進病毒在這些細胞中復制，出現(xiàn)ADE效應，導致患者臨床癥狀加重，出現(xiàn)血液濃縮和休克，造成DHF／DSS［12］。但是發(fā)現(xiàn)，許多一次感染的患者也可以出現(xiàn)DHF／DSS，說明本病還存在其他的致病因素。

細胞因子是由免疫細胞及其他類型細胞分泌的小分子量可溶性蛋白或多肽的總稱，具有在細胞間傳遞信息，調(diào)節(jié)免疫反應的功能，同時還參與炎癥損傷等病理過程。但是過度的炎癥反應能夠引起全身炎癥反應綜合征，使機體處于高代謝和高動力循環(huán)狀態(tài)。炎性細胞因子的過度釋放有可能進而引起多臟器功能障礙綜合征甚至導致死亡。在多種疾病的治療中，對炎癥反應的控制都非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，登革熱重癥患者中，IL－1，IL－4，IL－6，IL－13，TNF－α等水平明顯增高。TNF－α與血小板減少有明顯的相關(guān)性。研究顯示，Th1型反應向Th2型反應的轉(zhuǎn)變是DHF／DSS發(fā)生的一個重要機制，即重癥患者的細胞因子多為Th2型的細胞因子。病毒感染后，過量的細胞因子和炎性因子的釋放使得血管通透性增加，導致出血和休克［13－15］。

4 診斷

登革病毒的診斷主要是臨床癥狀結(jié)合實驗室診斷。登革病毒的實驗室診斷主要有病毒分離、抗原和抗體檢測、基因檢測等。

4.1 病毒分離 病毒分離是病毒病診斷的金標準。登革熱病毒血癥持續(xù)時間較短，應該在發(fā)熱開始的4～5d內(nèi)，采集樣品。病毒的分離培養(yǎng)可通過活蚊、細胞或動物進行?；钗茫ň尬煤鸵廖茫┓蛛x是目前最敏感的登革病毒分離方法，但對接種技術(shù)要求高而很少采用。蚊蟲細胞（C6／36、AP－61或 TRA－284）分離具有較高的敏感性。此外，也可利用哺乳動物細胞（BHK21、LLC－MK2）或乳鼠顱內(nèi)接種作為登革病毒的分離培養(yǎng)方法［16］。

4.2 抗原檢測 NS1蛋白是登革病毒感染的主要標志性抗原，NS1蛋白出現(xiàn)時間早于IgM 抗體，可用于早期診斷。目前，已有多個商品化試劑盒用于檢測登革病毒的NS1抗原。且研究發(fā)現(xiàn)NS1N端aa1－15多肽為DENV－1血清型特異性優(yōu)勢線性表位，提示該表位多肽可作為早期分型診斷登革病毒感染抗原試劑盒［17］。

4.3 血清學檢測 由于登革病毒感染患者的體液免疫反應在發(fā)病后至少可持續(xù)數(shù)周，標本可采集時間比較長，因此血清學的方法檢測更方便采用。檢測IgM、lgG捕獲法ELISA、檢測IgM、IgG間接法ELISA和血凝抑制試驗是登革病毒感染診斷最常用的血清學方法［18］。HI由于其敏感、簡便和重復性好而被用于初次感染和二次感染鑒別。由于HI檢測登革病毒感染與其他蟲媒病毒感染有交叉反應，基本已被檢測IgM和IgG捕獲法ELISA取代。基于登革病毒E／M蛋白特異性IgM和IgG捕獲法ELISA具有較高的敏感性、特異性操作更簡便等特點，是登革病毒感染血清學診斷最重要和最常用的檢測方法。IgG／IgM 抗體比率常用于區(qū)分初次和二次感染。但是，目前采用捕獲IgM／IgG比值法鑒別初次和二次感染尚無一致的標準，而且難于區(qū)分登革病毒的血清型［19］。

4.4 基因診斷 近年來，登革病毒的分子生物學診斷方法日益完善，核酸擴增成為快速診斷登革病毒的最重要方法，各種RT－PCR方法嘗試于檢測病毒的RNA。核酸擴增技術(shù)在進行檢測病毒的同時，也可以對登革病毒的血清型進行鑒別［20］。Harris等應用一步法多重RT－PCR，使反應在同一管中進行，并在登革病毒通用擴增引物間引入一段和PCR產(chǎn)物大小不同的無關(guān)序列，構(gòu)建成內(nèi)參質(zhì)粒，通過電泳分析PCR產(chǎn)物的片段大小來鑒別內(nèi)參和檢測靶標。內(nèi)參照的引入使RT－PCR結(jié)果的可靠性得到極大的提高［21］。

基因芯片（gene chips）技術(shù)因具有高通量和并行處理的特點，可對病原體進行綜合檢測和分析。更因其操作簡便快速、成本低、體積小等特點，在分子生物學、疾病診斷和治療等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。肖維威等［22］用PCR方法擴增含幾乎全長的2型登革病毒cDNA，酶切PCR擴增產(chǎn)物，通過建立2型登革病毒cDNA文庫獲取芯片探針。用點樣儀將探針制備成2型登革病毒檢測基因芯片，結(jié)果顯示樣品和2型登革病毒基因芯片雜交的敏感性強、特異性高［22］。

5 防制

5.1 治療 本病尚無有效的治療藥物，主要采取對癥支持療法，在治療中應避免使用阿司匹林和布洛芬。有關(guān)于利巴韋林、干擾素和阿糖腺苷等用于DF／DHF臨床病例的報道，但其療效有待進一步觀察。

5.2 預防 疫苗是預防登革熱最有效的途徑，然而，迄今仍沒有安全有效的疫苗用于登革熱的特異性預防。人類感染DENV后可產(chǎn)生型特異性中和抗體，對同型病毒的再感染具有免疫保護作用。但不同型的抗體之間不但沒有交叉免疫保護作用，而且還可能對異型病毒感染產(chǎn)生抗體依賴的感染增強作用（ADE）。因此，理想的DENV疫苗應該是能誘導人體產(chǎn)生對4種血清型DENV均有免疫保護作用的四價疫苗［23］。鑒于M和E蛋白包含了主要的中和性抗體表位，用于產(chǎn)生免疫的抗原主要選擇M與E蛋白。減毒活疫苗與滅活病毒、重組亞單位疫苗或重組DNA疫苗相比，具有能夠提供單劑量的快速免疫；誘導機體產(chǎn)生更長久的中和性抗體，同時有效誘導機體的T細胞免疫；成本較低，便于推廣等優(yōu)點，可以更好地誘發(fā)機體的保護性免疫反應。因而減毒活疫苗是目前首選疫苗的開發(fā)對象［24］。

6 展望

登革熱作為一種重要的蟲媒傳染病，發(fā)病人數(shù)逐年增加，嚴重危害著人類的健康。雖然其相關(guān)研究已經(jīng)取得了一定的成果，但有許多的問題亟待解決。登革熱的發(fā)病機制仍未有統(tǒng)一的共識，尤其是重癥病例，尚無有效預防與治療措施。今后的工作應該從病毒與宿主的相關(guān)機制上著手，早日獲得有效治療登革熱的方法，并開發(fā)出具有保護作用的多價疫苗。

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