松材線蟲病病原學研究的幾個問題

葉建仁，黃麟

(南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇省有害生物預防與控制重點實驗室，江蘇南京 210037)

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，可在短時間內(nèi)導致松樹死亡，是松樹上的一種毀滅性病害。該病寄主包括黑松、赤松和馬尾松等數(shù)十種松屬植物，也危害少數(shù)非松屬針葉樹［1］。日本1905年首次報道了該病在長崎縣引起松樹大面積枯死。目前該病分布于美國、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韓國、日本及中國等多個國家，其中在日本、中國和韓國發(fā)生最為嚴重［2-3］。我國自1982年在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)該病短短30年時間里，疫情已擴大到江蘇、安徽、廣東、浙江、山東、福建、江西、廣西、四川等16個省區(qū)，每年發(fā)生面積近10萬hm2，累計致死松樹5 000多萬株，直接經(jīng)濟損失25億元，間接損失250億元。近年來疫情擴散蔓延呈加劇之勢，已逼近黃山等著名風景名勝區(qū)、世界自然文化遺產(chǎn)地和重點生態(tài)區(qū)域，對我國大面積松林構成嚴重威脅，是我國最具危險性的頭號森林病害［4］。該病涉及到寄主松樹、線蟲、天牛、真菌、細菌以及環(huán)境因素等多個方面［5-6］，至今其致病機理尚未完全弄清，對其治理也較為被動，還沒有特別有效的防治措施。病原學的深入研究是揭示松材線蟲病致病機制和流行規(guī)律的前提，也是科學有效實施防治的基礎。關于該病的病原、致病分子機理等基礎性問題的研究有助于突破松材線蟲病研究中長期未能解決的關鍵問題，為該病的科學防控提供理論基礎。

1 松材線蟲病的病原

關于松材線蟲病的病原，長期以來松材線蟲被認為是該病的惟一病原，接種實驗發(fā)現(xiàn)松材線蟲能引起松樹萎蔫［7-9］。在接種的早期階段即樹脂分泌停止階段，松樹體內(nèi)線蟲量較少;當松樹針葉變黃時樹體內(nèi)線蟲的蟲口數(shù)快速增長，病情逐漸惡化;松樹死后線蟲數(shù)量又逐漸減少［10］。將松材線蟲經(jīng)制霉菌素、青霉素消毒后得到無菌線蟲，接種實驗證實無菌線蟲的致病性并未喪失［11］。研究還發(fā)現(xiàn)接種黑松1周后黑松的水分輸導即受阻，但松樹體內(nèi)的微生物相和健康松樹相似，直至接種5周后，藍變菌開始出現(xiàn)，細菌才開始增多，因此認為接種松材線蟲的致病性與其它微生物無關［12］。最新的研究發(fā)現(xiàn)從卵階段就開始無菌化處理獲得的無菌線蟲，在無菌條件下對無菌組培苗的致病性測定表明，無菌松材線蟲及帶菌松材線蟲接種均能使赤松和濕地松無菌苗發(fā)生萎蔫，無菌化處理并未使松材線蟲喪失致病性，而松材線蟲體表細菌單獨接種未能使無菌苗發(fā)病。無菌松材線蟲在發(fā)病植株體內(nèi)大量繁殖，病株體內(nèi)的線蟲回收后依然保持無菌狀態(tài)［13］，這些工作表明松材線蟲可以單獨引起松樹萎蔫，松材線蟲是導致松樹發(fā)病的直接原因。

早期的研究發(fā)現(xiàn)感染松材線蟲病的病木生理和組織病理學變化往往在線蟲數(shù)量快速增長之前出現(xiàn)，因此推測可能其他因素參與了該病的病理學過程，并認為松材線蟲攜帶的產(chǎn)毒素細菌 Pseudomonas spp.可能在松材線蟲病中發(fā)揮作用［14-15］。后來的研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲攜帶包括細菌和真菌在內(nèi)的大量伴生微生物類群［16-18］。有研究認為松材線蟲攜帶的伴生細菌在該病的病程中發(fā)揮重要作用，該病是由松材線蟲和伴生細菌共同引起的復合侵染病害。該觀點認為松材線蟲病是松材線蟲與其體表攜帶的致病細菌共同侵入寄主，致病細菌分泌毒素導致寄主萎蔫和死亡。松材線蟲攜帶細菌侵入樹體后，線蟲在為致病細菌提供營養(yǎng)和保護作用，而致病細菌在產(chǎn)毒和促進線蟲繁殖等方面起重要作用，二者對誘發(fā)寄主的萎蔫和死亡缺一不可。松材線蟲的無菌化處理會導致其致病性減弱，甚至完全喪失其致病性［19-26］。

但是目前松材線蟲攜帶細菌致病的觀點存在較大爭議。如很難對松材線蟲的致病性分化，特別是對同一地區(qū)的松材線蟲的致病性分化做出合理的解釋，在自然條件下存在部分松材線蟲蟲株完全喪失了致病力的現(xiàn)象，其中蟲株C14-5就是被廣泛使用的松材線蟲的無毒突變株［27-32］。另外，松材線蟲蟲株間攜帶細菌種類和數(shù)量差異較大［33-36］。不同地區(qū)、不同寄主體上致病力相同的蟲株，它們所攜帶的細菌種類和數(shù)量可能是不同的，或致病力不同的蟲株可能帶有相似的細菌菌株。目前的研究沒能從具有致病力不同的線蟲蟲株體表獲得有相同的或共同的優(yōu)勢細菌種類，因此很難做出其與致病性相聯(lián)系的合理解釋。此外，該觀點也無法很好的評價松材線蟲作為一種植物線蟲在松樹體內(nèi)的取食、移動、繁殖以及松材線蟲及其代謝產(chǎn)物與寄主植物互作過程中可能引起的植物細胞的破壞及病變反應在病程發(fā)展中的作用。植物線蟲對植物的致病作用已經(jīng)有大量的實驗證實［37-38］。因此，關于松材線蟲攜帶的細菌在松材線蟲病的致病過程中的作用，哪些細菌在松材線蟲的體表是普遍存在的，這些細菌是如何影響或發(fā)揮致病作用的，都還需要大量的研究給予進一步的證實。目前國內(nèi)外大量的有關松材線蟲病的致病性形成機制的研究工作主要還是將松材線蟲作為松材線蟲病的病原來展開的［39］。

2 松材線蟲致病性相關基因的研究

2.1 食道腺在松材線蟲致病中的作用 線蟲在侵染寄生過程中，用口針刺入植物組織中，食道腺分泌物通過口針注入植物細胞，這些分泌物可以改變細胞質以利于取食。與其他植物線蟲一樣，松材線蟲的食道腺位于其身體的前端，包括1個背食道腺和2個亞腹食道腺細胞［40］。線蟲食道腺分泌物含有高濃度的蛋白，在不同的寄生階段和不同的食道腺中蛋白的種類和數(shù)量均有差別［41-42］。食道腺分泌的蛋白可能在植物線蟲不同的寄生階段具有不同的作用，在線蟲侵染寄主植物的早期亞腹食道腺分泌的蛋白起主要作用，而在線蟲寄生后期亞腹食道腺開始萎縮，背食道腺活性明顯增加［43-44］。分泌物對植物細胞及其內(nèi)含物的修飾作用，有利于植物線蟲的取食與移動［41］。因此，基因表達位點分析可以作為植物線蟲致病基因功能分析的重要參考，如某些植物線蟲致病基因的作用位點在食道腺細胞，那么它們可能就與植物線蟲的取食、寄生和對寄主植物的致病性密切相關。目前，分析基因的表達位點可以通過對mRNA的原位雜交［45］以及針對蛋白的原位免疫熒光分析［46］確定。在對南方根結線蟲的研究中，采用微吸法獲得食道腺細胞內(nèi)含物并構建了食道腺特異表達的cDNA文庫，獲得包括185個含有信號肽序列的線蟲分泌蛋白cDNA的2 452個克隆，經(jīng)高通量的原位雜交的方法鑒定了37個含有信號肽序列，其中13個基因在亞腹食道腺表達，24個在背食道腺表達，并推測這些基因可能在南方根結線蟲致病過程中發(fā)揮重要作用［47］。

2.2 松材線蟲的致病相關基因克隆 植物線蟲在侵染植物過程中需要抵御寄主植物的防衛(wèi)反應，通過在寄主體內(nèi)取食和移動等來維持正常的生長發(fā)育和繁殖。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，越來越多的涉及線蟲在寄生過程中與致病相關的基因被克隆，這些基因的功能研究有助于對植物線蟲的寄生、致病機理做出科學的推測及闡釋。

2.2.1 內(nèi) 切 β-1，4-葡 聚 糖 酶 (β-1，4-endoglucanase) 植物細胞壁是植物抵御病原菌的物理屏障，病原物通過分泌細胞壁降解酶分解寄主植物細胞壁，侵入寄主植物組織，并從其酶解過程中獲得生長發(fā)育、繁殖及定殖于寄主植物必需的營養(yǎng)物質。植物細胞壁主要成分是纖維素，一些植物病原細菌和病原真菌，通過自身分泌的纖維素酶破壞植物組織細胞壁纖維素來侵染寄主植物［48-49］。植物線蟲的研究表明植物線蟲分泌物中也含有大量的纖維素酶蛋白，該類蛋白參與了植物線蟲對植物細胞壁的修飾作用，是一類植物線蟲重要的致病因子［50-52］。

纖維素酶包含有14個糖基水解酶家族，其中有5 個(GHF5，6，9，10，45)在動物研究中有報道，它們在系統(tǒng)進化上有明顯差異。利用松材線蟲蟲卵與蟲體的抑制消減雜交與RACE技術相結合的方法從松材線蟲中克隆的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因ENGL1，全長cDNA為797 bp，包含1個675 bp的開放閱讀框，5′非翻譯區(qū)長24 bp，不含有線蟲剪接引導序列SL1，3′非翻譯區(qū)長97 bp，含有加尾信號序列TATAAA。ENGL1含有1個 N-糖基化位點(84 NLSY)、5個蛋白激酶磷酸化位點、5個酪蛋白激酶II磷酸化位點、6個N端?；稽c、1個酰胺化位點和1個Prokaryotic membrane lipoproteinlipid attachment site和1個糖基水解酶GHF45家族活性位點(21 TTRYWDCCKPSC)。ENGL1含有2個低復雜度區(qū)域，分別為 4Lys-15Ala，58Gly-70Ser(53)。ENGL1與數(shù)據(jù)庫中松材線蟲內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶蛋白 ACD12136，BAD34546，ACN42745的相似性分別為99%，91%，75%。與ACD12136的相似性最高，二者的氨基酸序列僅有3個殘基差異，分別出現(xiàn)在ENGL1信號肽序列的6L的缺失和11D殘基取代了G，以及216E殘基取代了K殘基。

目前在松材線蟲上發(fā)現(xiàn)GHF45家族蛋白內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的催化活性位點與真菌短帚霉和米根霉的GHF45家族高度相似，而在自由生活線蟲秀麗隱桿線蟲和Caenorhabditis briggsae的全基因組中并沒有發(fā)現(xiàn)GHF45家族基因，因此認為該類基因可能通過水平基因轉移的方式從真菌中獲得。真核表達產(chǎn)物分析表明，松材線蟲的Bx-eng-1是以非糖基化的單體形式存在，而Bx-eng-2和Bx-eng-3是以糖基化的二聚體形式存在，體外表達產(chǎn)物的酶學性質分析表明三者具有相似的酶學特性，其最適的pH為6.0，最佳活性溫度為60℃［53-54］。RNAi研究表明，dsRNA浸泡24 h能顯著導致該基因的轉錄后基因沉默效應，降低其纖維素酶活性，同時浸泡處理能顯著減少F1的線蟲個體數(shù)量，因此認為該基因可能在松材線蟲的致病性和線蟲的取食、發(fā)育和繁殖中發(fā)揮作用［55］。

2.2.2 內(nèi) 切 β-1，3-葡 聚 糖 酶 (β-1，3-endoglucanase) β-1，3-葡聚糖酶催化水解 β-1，3-D-葡聚糖糖苷鍵，內(nèi)切 β-1，3-葡聚糖酶和外切 β-1，3-葡聚糖酶兩大類。該類酶廣泛分布于細菌、真菌和高等植物。細菌β-1，3-葡聚糖酶的功能主要是真菌細胞壁的降解從而有利于細菌的營養(yǎng)攝取;真菌中該酶參與真菌的細胞發(fā)育與分化，并在植物病原真菌與寄主的互作中發(fā)揮重要功能;植物中的參與了植物細胞分化和對病原真菌的防御反應［56-58］。在海洋無脊椎動物和線蟲中均有β-1，3-葡聚糖酶基因克隆的報道［59-60］。

Kikuchi等［61］分別從松材線蟲和擬松材線蟲中克隆了1個內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶基因 Bx-lam16A，推導氨基酸序列含有明顯的信號肽特征序列和GHF16家族保守序列殘基，BxLAM16A與來自Xanthomonascampestris，X．Axonopodis，Pseudomonas sp.的β-1，3-葡聚糖酶的相似性達到了49%～43%。BxLAM16A體外表達產(chǎn)物酶活性分析發(fā)現(xiàn)，該酶對可溶性的β-1，3-葡聚糖昆布多糖的水解活性最高，β-1，3-1，4-交聯(lián)葡聚糖表現(xiàn)出較低活性，β-1，4-交聯(lián)葡聚糖底物無催化水解活性。該酶活最適pH為4.9，最適溫度為65℃，該蛋白的表達位點為食道腺細胞，推測該基因可能參與了松材線蟲對植物細胞壁的修飾作用。序列同源性分析表明細菌β-1，3-葡聚糖酶屬于GHF16家族，而大多數(shù)植物和真菌源的β-1，3-葡聚糖酶則屬于GHF17家族。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)BxLAM16A與來自細菌的GHF16家族高度同源，而與來自其他動物的系統(tǒng)發(fā)育關系較遠，認為該基因很可能是通過水平基因轉移的方式從原核生物中獲得的。

2.2.3 果膠質酶 植物細胞果膠質沉積于初生細胞壁和細胞間層，在初生壁中與不同含量的纖維素、半纖維素、木質素的微纖絲以及某些伸展蛋白相互交聯(lián)，使得細胞組織結構堅硬，表現(xiàn)出固體的形態(tài)，同時構成抵御病原微生物入侵的天然屏障［62］。果膠酶通過β-消去反應催化降解α-1，4-果膠酸鹽，該反應在果膠質的降解過程中發(fā)揮了重要作用［63］。果膠酶廣泛存在于植物病原細菌、真菌和線蟲中，主要作用是降解植物細胞壁從而有利于病原物的侵入和定殖［63］。在植物線蟲中，果膠質酶在食道腺細胞產(chǎn)生，通過口針分泌進入植物細胞，在侵染和致病性等方面發(fā)揮重要作用。在部分孢囊線蟲和根結線蟲中均有果膠質酶基因克隆的報道［64-66］。

目前從松材線蟲中成功克隆了2個果膠酶基因Bx-pel-1和Bx-pel-2，推測的氨基酸序列BxPEL1和BxPEL2的N端含有明顯的信號肽特征序列，與多糖降解酶家族3PL3有著較高的相似性，BxPEL1和BxPEL2的氨基酸序列相似性為64%。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)Bx-pel-1在植物線蟲的食道腺部位特異表達。體外重組蛋白活性分析表明，BxPEL1對聚半乳糖醛酸具有明顯的催化降解活性，而對甲基化果膠質具有較低的催化降解活性，研究還發(fā)現(xiàn)Bx-PEL1為Ca2+依賴蛋白，其最適溫度是55℃，最適pH 是 8 ～10［67］。

2.2.4 過氧化物酶(Peroxidase) 活性氧的產(chǎn)生在植物的免疫防衛(wèi)反應和對病原物的識別中發(fā)揮著重要作用，其參與了信號傳導、抑菌作用、membrane lipoxidation、細胞壁修飾、誘導抗性和細胞過敏性壞死［68-69］。而病原物則通過產(chǎn)生抗氧化劑來有效抵御寄主的活性氧防衛(wèi)反應［70］。因此，能否清除寄主植物產(chǎn)生的活性氧就成為病原物能否在寄主植物體內(nèi)成功定殖的關鍵。在真核生物中，主要的抗氧化劑包括對超氧根陰離子具有解毒作用的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)和 Peroxiredoxin(Prx)等。有研究發(fā)現(xiàn)植物線蟲的真皮層能夠分泌一種硫氧化蛋白過氧化物酶，該蛋白具有特異代謝過氧化氫的活性，推測該蛋白可能與線蟲抵御植物防衛(wèi)反應有關［71］。谷胱甘肽過氧化物酶是生物消除過氧化氫抵御氧脅迫的主要方式。Prx蛋白屬于抗氧化蛋白超家族，在原核生物、植物、無脊椎動物和哺乳動物中廣泛存在［72］。大量的研究表明，Prx蛋白在病原物與寄主植物的互作中發(fā)揮重要作用，是許多病原物防治的重要靶標［73］。Prx作為抗氧化還原酶對過氧化氫的分解需要有氧化還原活性半胱氨酸的參與。根據(jù)其保守Cys的數(shù)目不同，可以分為2個亞家族，即1-Cys Prx和2-Cys Prx。Prx與過氧化氫酶和GPX不同，其催化活性不需要金屬離子或者輔基等氧化還原因子的參與［74］。

在松材線蟲中有1個Prx基因BxPrx已經(jīng)被克隆，BxPrx含有2個保守的半胱氨酸位點Cp和Cr，1個threonine-cysteine-arginine催化三元體，2個對過氧化氫敏感的標簽元件GGLG和YF。保守結構域分析和三維結構模擬的結果都表明BxPrx具有氧化還原功能。BxPrx盡管沒有信號肽結構，但其結構中還有23個連續(xù)的疏水氨基酸形成α-螺旋的跨膜結構，BxPrx在不含有信號肽的條件下，可能依賴于這一跨膜結構或ATP結合盒轉運子實現(xiàn)其跨膜運輸。體外表達產(chǎn)物的酶活分析表明BxPrx在以谷胱甘肽作為電子供體的情況下表現(xiàn)出了對過氧化氫的還原活性［75］。

2.2.5 擴展蛋白(Expansin) 擴展蛋白是植物生長發(fā)育過程中具有調節(jié)功能的重要蛋白，該蛋白通過在植物細胞壁中的纖維素纖絲和基質多糖交叉處，以一種可逆的方式作用于微纖絲表面的基質聚合物，使多聚網(wǎng)絡間的非共價鍵斷裂，促進聚合物滑動，在植物細胞壁的生長和分解等方面發(fā)揮重要作用，該類蛋白在植物線蟲中普遍存在［76-78］。Kikuchi等［79］從松材線蟲和擬松材線蟲中分離獲得的擴展蛋白在食道腺細胞的特異表達，與來自馬鈴薯金線蟲等植物線蟲的擴展含有碳水化合物結合位點不同，在松材線蟲和擬松材線蟲的擴展蛋白中不含有類似的結合位點，推測該基因參與了寄主植物與植物線蟲的互作，最有可能在協(xié)助線蟲在植物體內(nèi)的移動方面發(fā)揮重要作用。

2.2.6 毒液過敏蛋白(Venom allergen-like protein)

毒液過敏蛋白作為SCP蛋白家族成員，在真核生物中普遍存在，在其結構中含有SCP/TAPS保守結構域，許多含有這一結構域的蛋白為胞外泌出蛋白［80-81］。研究發(fā)現(xiàn)該類基因在大豆孢囊線蟲和南方根結線蟲等植物線蟲的寄生階段高量表達，但其功能尚不清楚［82-84］。

從松材線蟲中克隆了3個類毒液過敏蛋白Bxvap-1，Bx-vap-2，Bx-vap-3，表達位點都位于松材線蟲的食道腺細胞。結構分析發(fā)現(xiàn)3個基因都含有信號肽特征序列及SCP/TAPS保守序列，表達量分析發(fā)現(xiàn)Bx-vap-1在松樹體內(nèi)的繁殖型階段的蟲體上表達量最高，dsRNA介導的Bx-vap-1基因沉默顯著降低了松材線蟲在松樹體內(nèi)的遷移速率［85］。因此，該基因的功能可能協(xié)助線蟲在樹體內(nèi)的遷移，參與了植物線蟲抑制寄主植物的防衛(wèi)反應。

3 松材線蟲病流行的病原學研究

收集我國1982-2005年間松材線蟲病疫情普查數(shù)據(jù)、專項調查報告、疫情分析報告、國家報告等資料，應用地統(tǒng)計學和克里格插值方法分析松材線蟲病在我國的空間分布結構和空間相關性。在全國和江蘇、安徽、廣東、浙江5個不同空間尺度下，松材線蟲病發(fā)生疫點的空間半變異函數(shù)均為球形，在空間格局上呈聚集分布。松材線蟲病在中國有著2個明顯的聚集分布區(qū)域，一個位于30.5～32.5 N，117.7～120.5 E，以南京為中心，包括江蘇、安徽大部和浙江西北部;另一個位于22.5～24 N，113～114.5 E，在廣東境內(nèi)［86］。

對收集自我國13個省、49個縣(市、區(qū))的173個松材線蟲蟲株以及南京林業(yè)大學江蘇省有害生物預防與控制實驗室保存的部分來自美國、日本的松材線蟲蟲株和擬松材線蟲蟲株的RAPD分析及遺傳多樣性分析表明，松材線蟲與擬松材線蟲種間與種內(nèi)都存在著較高的遺傳多樣性，且二者種間的遺傳變異大于種內(nèi)。中國松材線蟲群體間的遺傳相似性較高，平均在0.9以上，與日本的平均遺傳距離是0.274 2，與美國的是0.424 2，中國群體與日本群體的親緣關系比與美國更為接近。山東長島群體與日本群體的遺傳距離僅為0.15［87］。

松材線蟲的遺傳多樣性分析同樣證實我國存在以廣東和江蘇為中心的2個聚集分布區(qū)，但2個聚集分布區(qū)形成原因迥異，蘇皖聚集分布區(qū)域的形成是松材線蟲病傳入南京后依靠自然或人為因素不斷圍繞始發(fā)區(qū)域向外擴散的內(nèi)源性擴散所致，區(qū)域內(nèi)各疫點松材線蟲具有較高的同源性，很可能來自同一個疫源。廣東聚集分布區(qū)各域疫點間松材線蟲的遺傳特性具有一定的異質性，其形成主要體現(xiàn)為外源性，是由于區(qū)域外松材線蟲的不斷入侵所致［87］。

根據(jù)各線蟲蟲株的遺傳相似性模擬的松材線蟲在我國可能的傳播路徑發(fā)現(xiàn)，安徽松材線蟲疫源最初很可能來自江蘇，此后在全省范圍內(nèi)流行。廣東松材線蟲病可能存在不同的源頭，東莞市和韶關市乳源縣疫情最有可能來自浙江寧波的象山市，惠州市惠城區(qū)和廣州增城市的松材線蟲可能分別源自不同的國外地區(qū)。象山市疫點疫源最有可能來自安徽，杭州富陽市可能有2個分別來自國外的疫源。江西贛州市章貢區(qū)疫情最有可能來源于安徽馬鞍山。湖南益陽市松材線蟲可能分別來源于國外、浙江和貴州等3個不同區(qū)域。廣西桂林和防城港兩地疫情均可能來自象山市。湖北恩施市松材線蟲最有可能由安徽馬鞍山、明光等地傳入。貴州遵義縣松材線蟲可能來源于浙江舟山市普陀區(qū)。四川鄰水縣松材線蟲與全國大部分地區(qū)松材線蟲具有較高的同源性，從浙江、江蘇和廣西傳入的可能性大。重慶松材線蟲來源于安徽、廣西、浙江和江蘇的可能性較大。山東省松材線蟲來自于日本［87］。以上可能的疫情傳播路徑充分反映了松材線蟲病疫情主要依賴于人為因素傳播而呈現(xiàn)出跳躍式發(fā)展的特點。Cheng等［88］早期采用AFLP對來自我國的松材線蟲28個蟲株、美國4個蟲株和日本2個蟲株的遺傳多樣性分析與可能的傳播路徑分析認為，該病的疫情最早起源于廣東，一條傳播路徑是由廣東傳播至安徽、浙江;另一條是由廣東傳入江蘇，再至湖北、重慶、貴州和安徽明光地區(qū)。兩種觀點都認為廣東是松材線蟲病疫情在我國流行的一個重要的傳播源。但也存在差異，后期的研究認為江蘇也是該病另外一個傳播源，造成這種差異的原因可能與疫情后期的進一步發(fā)展和樣本收集數(shù)量進一步豐富有關。

松材線蟲病疫情數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結果分析也表明，該病在我國的傳播方式以人為成分為主。人為傳播載體中，37.66%是由于調運感病松木攜帶傳入，41.56%是隨貨物包裝流通傳入，18.18%是由于實施電網(wǎng)改造工程時大量電纜盤攜帶傳入，2.60%是架設通訊設備時光纜盤攜帶傳入。其在我國快速擴散蔓延是由大量攜帶病原的木包裝材料境外傳入、國內(nèi)疫區(qū)疫木管理不嚴、檢測檢驗手段落后、疫情監(jiān)測不及時等原因共同造成的［87］。

4 展望

4.1 松材線蟲伴生微生物的多樣性 自然界松材線蟲存在伴生微生物是一種普遍現(xiàn)象，有關松材線蟲與伴生真菌的研究認為伴生真菌在松材線蟲病的后期階段松樹細胞死亡后可以作為線蟲的飼料維持線蟲正常的種群繁衍，伴生真菌也可以通過松材線蟲及其傳播媒介在天牛羽化階段實現(xiàn)真菌生存領域的擴展和種群的擴張，二者形成互惠關系［89-92］。關于細菌與松材線蟲的關系，特別是與松材線蟲致病性的關系目前還存在爭議，正如前文所述。同時關于松材線蟲伴生細菌的攜帶部位，早期的研究認為松材線蟲的伴生細菌只分布在松材線蟲的體表，而在體內(nèi)沒有觀察到細菌的存在［93］。但最近的研究認為松材線蟲和擬松材線蟲的腸道區(qū)內(nèi)均有細菌的存在，并且從體表無菌的松材線蟲和擬松材線蟲分離獲得了線蟲體內(nèi)細菌，包括寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和愛文氏菌屬Ewingella在內(nèi)的細菌類群［94］。但關于松材線蟲體內(nèi)細菌存在的普遍性與獲取方式以及體內(nèi)細菌對松材線蟲的影響、與線蟲的協(xié)同進化等諸多方面的研究都有待于進一步深入。

4.2 松材線蟲的功能基因的研究與利用 松材線蟲基因組測序工作初步完成，測完18 000多個基因，為揭示松材線蟲的致病基因奠定了重要基礎［39］。為了充分闡明松材線蟲病的分子機制，還有必要在已知基因組信息的基礎上借助松材線蟲的轉錄組測序與表達譜分析，特別是結合該病的病程篩選松材線蟲及與寄主互作過程中的病程相關效應因子，這無疑是松材線蟲致病機制的關鍵環(huán)節(jié)。目前，多種植物寄生線蟲大規(guī)模的EST測序以及cDNA文庫的測序為植物寄生線蟲致病相關的基因的研究提供了數(shù)以萬計的表達序列標簽［47，64，66，95］，結合基因組表達譜分析及其他模式生物的功能基因注釋信息，獲得了包括果膠裂解酶［66］、多聚葡聚糖醛酸酶［96］、β-1，4-木聚糖酶［97］和 β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶［98］在內(nèi)的大量植物寄生線蟲致病相關基因。其中松材線蟲的混合階段、分散型幼蟲階段轉錄組分析，以及松材線蟲和擬松材線蟲轉錄組的比較分析［95，99］，為松材線蟲的致病性、發(fā)育、生態(tài)適應性等性狀相關功能基因的挖掘與利用提供了重要的材料。

隨著松材線蟲基因組和轉錄組的測序，數(shù)據(jù)庫中積累了大量松材線蟲的基因序列信息，但目前僅有非常有限的基因獲得了明確的功能注釋。目前從松材線蟲克隆的與致病性相關的基因主要有細胞纖維素酶GHF45家族、果膠酶、擴展蛋白、毒液過敏蛋白、過氧化物還原蛋白等基因［75，79，85，100-101］。關于這些基因的功能分析大都采用同源性比對和體外表達產(chǎn)物的酶學分析方法進行，但這類方法只能滿足于某些酶類的功能分析，而對一些非酶類的基因功能分析則受到很大限制。此外由于酶學功能分析大多借助于原核和真核體外表達系統(tǒng)進行，因此也很難完全闡明該基因的確切功能以及該基因在宿主體內(nèi)的差異表達可能導致宿主的表型變化。近年來，隨著RNAi干擾技術在植物線蟲基因功能分析方面的應用發(fā)展，也被用于松材線蟲基因功能的鑒定［55，76，102-104］。盡管目前已經(jīng)有部分學者開展了松材線蟲部分催化酶的 RNA 干擾研究［55，103-104］，但還沒有關于松材線蟲致病相關基因RNA干擾后松材線蟲致病力變化的報道，特別是干擾后線蟲對松樹的致病力的變化。此外，目前的報道大多基于浸泡法進行松材線蟲的RNA干擾，但由于浸泡法具有不持續(xù)性和干擾效果逐步衰退的劣勢，使其應用受到很大限制。松材線蟲有不同于秀麗線蟲和其他植物寄生線蟲的特性，松材線蟲在離體條件下具有取食部分真菌菌絲的特點，這就使得構建由真菌介導的高效、穩(wěn)定的RNAi干擾體系成為可能。可被松材線蟲取食的真菌包括灰葡萄孢、擬盤多毛孢、盤多毛孢等多種真菌［105］。初步研究表明異角狀擬盤多毛孢真菌遺傳轉化體系的建立為今后探討由真菌飼喂法實現(xiàn)松材線蟲功能基因的持續(xù)高效的RNAi干擾效應成為可能［106］。

功能基因的正確表達調控作為基因功能實現(xiàn)的重要方面，siRNA、miRNA及其他小RNA等非編碼RNA參與了生命活動的基因的表達調控，其中包括轉錄、染色體的形成、RNA的剪接和修飾、mRNA的穩(wěn)定和翻譯、蛋白質的穩(wěn)定和轉運，其中miRNA的表現(xiàn)尤為突出。miRNA在動植物、微生物的生長、發(fā)育、繁殖、致病等方面發(fā)揮重要作用。在秀麗新桿線蟲中發(fā)現(xiàn)部分miRNA在線蟲的發(fā)育過程具有重要的調控作用，同時也為研究線蟲的轉錄后調控研究提供了重要借鑒［107-108］。在松材線蟲的研究中目前僅見Huang等［109］通過深度測序的方法分析了不同地理來源的松材線蟲miRNA，共發(fā)現(xiàn)了810個miRNA，其中含有保守的miRNA 49個。miRNA可能在松材線蟲的生態(tài)適應性和進化中具有重要作用。但關于這些miRNA的靶標基因及其對靶標基因的調控等方面的研究還未見相關報道。致病相關基因的表達調控研究是研究松材線蟲致病分子機制的重要方面，由于miRNA在基因的表達調控方面，尤其是mRNA的轉錄后調控具有重要的作用，也將是松材線蟲致病機制研究的重要方面。

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