MTT法檢測(cè)香葉木苷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的影響

蘇秀莉，盧衛(wèi)紅，張浩，趙越

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150001)

香葉木苷(dosmin，3'，5，7 － 三羥基 4'－ 甲氧基黃酮－7－蕓香糖)是從茜草科藥用植物蓬子菜(Galium verum L．)中提取出的含量豐富黃酮苷類化合物［1］，蓬子菜是中國(guó)東北的一種野生植物，這種植物以維生素的優(yōu)良的食物來(lái)源而著稱，它還包含綠原酸，水楊酸和黃酮類等物質(zhì)，在東北民間藥用歷史悠久，具有清熱祛濕、活血止癢的功效，近10余年來(lái)，臨床應(yīng)用不同劑型治療下肢靜脈炎療效顯著。香葉木苷具有增加靜脈張力，改善靜脈通透性，改善微循環(huán)的作用，從而減輕肢體水腫，在國(guó)內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)臨床報(bào)道［2－4］。香葉木苷具有消炎和止痛的藥效，柑橘中獲得的類黃酮香葉木苷具有抗虐、抑制癌細(xì)胞增殖作用，還可以作為中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜劑并具有輔助睡眠，縮短入睡時(shí)間的顯著功效，同時(shí)它還是治療疾病的特殊藥效物質(zhì)，可以增加肌肉強(qiáng)度，抵抗靜脈血管炎癥，慢性血管炎，風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎，抗氧化，抗脂質(zhì)過(guò)氧化的功效，細(xì)胞保護(hù)，治療急性和慢性的胃潰瘍和十二指腸潰瘍［5－7］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)從蓬子菜中分離了香葉木苷，并且進(jìn)行了香葉木苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)等研究［8］。

臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，簡(jiǎn)稱HUVECs)是一種干細(xì)胞，能無(wú)限次傳代(理論上)，易于實(shí)驗(yàn)操作。

MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。最終結(jié)果在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，按下面公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1－加藥組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

香葉木苷的研究前期主要集中在從蓬子菜中分離提取純化及在動(dòng)物體內(nèi)的功能，幾乎沒(méi)有作用于細(xì)胞方面的研究，本實(shí)驗(yàn)從香葉木苷作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞入手，優(yōu)化出最佳加藥濃度和最優(yōu)加藥實(shí)驗(yàn)，為后期研究相關(guān)香葉木苷作用于細(xì)胞的蛋白質(zhì)組研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1．1 細(xì)胞來(lái)源 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供。

1．2 藥材與試劑 香葉木苷(由蓬子菜分離提取，蓬子菜采自黑龍江省鏡泊湖地區(qū)和哈爾濱郊區(qū)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院于加賓教授鑒定，香葉木苷由哈爾濱工業(yè)大學(xué)盧衛(wèi)紅副教授分離提取［9］);改良型RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國(guó)HyClone公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)Amresco公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Amresco公司);青－鏈霉素(碧云天公司)。

2 方法

2．1 培養(yǎng)基的配置 H－1640培養(yǎng)基按照90%RPMI－1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL比例配置。配置好的培養(yǎng)基封口放入4°冰箱保存。

2．2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng) 將凍存細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中并輕輕晃動(dòng)使其迅速融化，立即放入離心機(jī)離心(1 000r/min，5min)，吸去上層液體，加入1ml培養(yǎng)基輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單個(gè)，轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加入1mL培養(yǎng)基，放入37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞，2～3天更換培養(yǎng)基［10］。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng):用胰蛋白酶EDTA消化法。待細(xì)胞融合成單層后，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS液洗滌瓶壁，加2mL，25g/L胰蛋白酶，作用1min后吸去消化液，室溫下繼續(xù)作用，一邊在倒置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞皺縮、彼此分離或單層細(xì)胞出現(xiàn)網(wǎng)孔狀即可終止消化。加入培養(yǎng)液，吸管吹打，制成細(xì)胞懸液，按1∶2比例將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)滿單層，用同法繼續(xù)傳代培養(yǎng)［10］。

2．3 最優(yōu)藥物濃度的選擇 設(shè)置10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL 六個(gè)藥物濃度組及對(duì)照組。按1×105個(gè)/mL密度接種細(xì)胞于96孔板中，每孔100μL，每種濃度設(shè)4孔重復(fù)，邊緣空白孔加PBS保持濕度。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，待細(xì)胞貼壁后按照分組加入藥物，24h后每孔加入20μLMTT，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37℃的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加150μl DMSO，于搖床上搖10min，酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

2．4 最優(yōu)加藥時(shí)間的確定 將細(xì)胞按1×105個(gè)/mL密度接種細(xì)胞于96孔板中，每孔100μL，共三組，分別標(biāo)注為A(24h)、B(48h)和C(72h)，每組4孔重復(fù)并設(shè)置對(duì)照組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后選擇上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的最佳藥物濃度加藥，24h后取出A組每孔加入20μLMTT，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37℃的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加150μL DMSO，于搖床上搖10min，酶標(biāo)儀上于490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。B和C組分別于48h和72h后進(jìn)行相同處理。

3 結(jié)果

3．1 最優(yōu)藥物濃度為20μg/mL 24h后進(jìn)行MTT檢測(cè)得到的結(jié)果如圖2。最優(yōu)藥物濃度為20μg/mL，而對(duì)照組的OD值為0．905，低于20μg/mL加藥組的結(jié)果，說(shuō)明這個(gè)濃度的香葉木苷對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

3．2 最優(yōu)加藥時(shí)間為48h 經(jīng)MTT檢測(cè)后得到圖3的結(jié)果，證明48h是最優(yōu)加藥時(shí)間。

圖1 不同濃度藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

圖2 不同加藥時(shí)間對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

表1 不同濃度香葉木苷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制率

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制

圖3 香葉木苷濃度抑制率曲線

圖4 香葉木苷培養(yǎng)時(shí)間抑制率曲線

計(jì)算得到的香葉木苷藥物對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制率如表1。從表1可看出香葉木苷對(duì)細(xì)胞的抑制作用為先降低后增高，在20μg/mL時(shí)達(dá)到最低，為負(fù)值，進(jìn)一步說(shuō)明此時(shí)藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。但是隨著濃度的進(jìn)一步增大，香葉木苷對(duì)細(xì)胞的抑制率逐漸增大，表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用。由此得出香葉木苷作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的最佳藥物濃度為20μg/mL。

圖3可知，香葉木苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，抑制作用先減小再增大，在48h時(shí)抑制作用最低。經(jīng)軟件分析，香葉木苷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%所需的用量即IC50為254.8μg/mL。

4 討論

圖1中香葉木苷濃度為20μg/mL時(shí)的OD值達(dá)到了0.911，而本組實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組即未加藥的細(xì)胞OD值才為0.905，說(shuō)明此時(shí)香葉木苷對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，同時(shí)抑制率和抑制率曲線也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論，IC50的值也說(shuō)明香葉木苷需要很大濃度時(shí)才能使細(xì)胞的死亡率達(dá)到50%。抑制率在20μg/mL時(shí)達(dá)到了負(fù)值，也就說(shuō)這個(gè)時(shí)候的作用是促進(jìn)而不是抑制。

圖2和圖4說(shuō)明了時(shí)間對(duì)香葉木苷作用于細(xì)胞的影響，即抑制作用先降低后增大，在48h時(shí)抑制作用是最低的。時(shí)間試驗(yàn)的抑制率先降低后增加，可能的原因是香葉木苷剛加入時(shí)對(duì)細(xì)胞有個(gè)適應(yīng)的過(guò)程，此時(shí)表現(xiàn)為抑制，但隨著加入的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞表現(xiàn)出適應(yīng)狀態(tài)，抑制率逐漸降低，在48h時(shí)達(dá)到最低，即達(dá)到最佳加藥濃度。

從以上結(jié)論來(lái)看，香葉木苷除在動(dòng)物個(gè)體上有具有增加靜脈張力，改善靜脈通透性，改善微循環(huán)等作用，在細(xì)胞層面上合適的濃度和一定的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用，這就為下一步研究形成靜脈血栓及香葉木苷治療靜脈血栓發(fā)揮作用的相關(guān)蛋白奠定基礎(chǔ)。

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