變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A的表達、純化與鑒定

武文琦 叢旭珍 殷愛紅 胡 家 翟方麗 李慎濤*

(1.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學和免疫學系，北京100069;2.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069;3.青島阜外心血管病醫(yī)院檢驗科，青島266034)

變異鏈球菌(streptococcus mutans)是齲病的主要致病菌，也是某些非口腔疾病(如亞急性細菌性心內(nèi)膜炎)的病原菌，具有廣泛的適應能力，可以持續(xù)存在于口腔中。在世界范圍內(nèi)，不同種族、不同社會經(jīng)濟背景的人群中均可分離出此菌，但并非所有人都表現(xiàn)齲病。研究［1］顯示，不同齲指數(shù)患者口腔變異鏈球菌的體外致齲能力不同，提示不同菌株的致齲性是不同的，而致齲性主要是通過其毒力因子來完成的，但其感染途徑和致病機制至今尚未得到滿意的解答。隨著S.mutans UA159基因組測序工作的完成，相關(guān)的理論研究［4］也更加深入細致。

核糖-5-磷酸異構(gòu)酶也叫D-核糖-5-磷酸乙酮醇異構(gòu)酶，是自然界中廣泛存在的一種高度保守的蛋白酶，參與原核和真核生物的糖代謝(如磷酸戊糖途徑)，同時在植物二氧化碳固定的卡爾文循環(huán)中，它是催化5-磷酸核糖和5-磷酸核酮糖相互轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵酶［2-3］。這些代謝參與還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成以及戊糖的氧化、非氧化合成［4］。有研究［5］表明，人類缺乏核糖-5-磷酸異構(gòu)酶會引起髓鞘的損傷，從而導致諸如白質(zhì)腦病以及包括周圍神經(jīng)病變等在內(nèi)的神經(jīng)元異常。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶以核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A(RpiA)和核糖-5-磷酸異構(gòu)酶B(RpiB)這2種類型存在，它們都能催化5-磷酸核糖和5-磷酸核酮糖的相互轉(zhuǎn)變，但是它們卻幾乎沒有什么關(guān)聯(lián)。RpiA是自然界中最廣泛存在的，幾乎存在于所有的組織中［6］，而 RpiB卻只在細菌和真核物種中發(fā)現(xiàn)［7］。RpiA和RpiB能夠催化相同的反應并且在大部分的器官中至少存在一種。盡管核糖-5-磷酸異構(gòu)酶的重要性早已被確定，但對RpiA和RpiB的催化機制卻所知甚少。

本文中所研究的rpiA由變異鏈球菌(streptococcus mutans，Smu)UA159株基因組所編碼，相對分子約為24 000。此菌屬革蘭陽性菌，是最主要的齲齒致病菌之一。對rpiA克隆、表達與純化將有助于闡明其生物學功能，通過尋找其相互作用蛋白及小分子化合物，為進一步研制抗變異鏈球菌的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

Streptococcus mutans UA159由北京大學口腔醫(yī)學院郭麗紅教授惠贈;原核表達載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株XL-1及表達菌株BL21(DE3)均為本實驗室保存;DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司(美國);DNA片段膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omiga公司;Glutathione SepharoseTM4B購自美國 GE公司;Sephadex G25、Resource Q預裝柱購自美國GE公司。引物合成及DNA測序由上海生工公司完成。

制冷恒溫搖床，Thermo公司;超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司JY92-2D;電泳儀，BIO-RAD，PowerPac3000;高速離心機，BECKMAN J2-HS;凝膠成像處理系統(tǒng)，GE healthcare Image Quant 300;AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)，美國 GE公司; MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀，德國BRUKER公司。

1.2 方法

1)目的基因片段的擴增：根據(jù)GenBank中變異鏈球菌UA159株基因組(AE014133)序列，設(shè)計特異性引物，分別添加BamHI和XhoI酶切位點。以UA159基因組為模板，PCR擴增核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A的編碼序列。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

2)克隆及鑒定：將膠回收的PCR產(chǎn)物用BamHI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的載體pGEX-6p-1按5∶1濃度混合，在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E coli XL-1 blue，涂布到含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過夜，次日從LB平板上采用抽簽法隨機挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 mg/ L)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒再進行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測序。

3)誘導表達分析：用測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，采用抽簽法隨機挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜，次日，按1∶100的比例將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到5 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當培養(yǎng)液OD600值達到0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，誘導表達8～12 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體，取適量菌體用 SDSPAGE分析蛋白表達情況。

4)蛋白表達形式分析及表達條件的優(yōu)化：分別對在不同誘導溫度、不同IPTG終濃度、不同誘導起始培養(yǎng)液OD600值及不同誘導時間4種條件下誘導蛋白表達，4 000 r/min離心15 min收集菌體，用PBS(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.8 mmol/L KH2PO4)重懸菌體，4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶(終濃度至1 g/L)、DTT(終濃度至1 mmol/ L)、PMSF(終濃度至1 mmol/L)，冰上作用30 min，然后，在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000 r/min離心50 min，分別收集上清和沉淀，用SDS-PAGE分上清和沉淀中的目標蛋白，從而確定目標蛋白的表達形式。

5)重組蛋白的誘導表達：將核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A工程菌接種于20 mL含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接于1 L含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，當培養(yǎng)液OD600值達到0.6時，加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，于16℃下誘導表達20 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體用于目標蛋白的純化。

6)重組蛋白的純化：將誘導表達的菌體用超聲破菌，離心收集上清，加到已用PBS平衡的Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱上，讓其自然通過柱，然后用PBS洗滌雜蛋白，用酶切緩沖液(25 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/LDTT，pH 7.5)平衡柱，加入200μL(1 g/L)PreScission蛋白酶，于4℃酶切過夜。次日，用 PBS洗脫，收集穿過的蛋白樣品，用15%的SDS-PAGE鑒定。

收集目標蛋白，用Sepherdex G25柱脫鹽，緩沖液用陰離子交換A液(25 mmol/L Tris、1 mmol/L DTT，pH 7.5)，隨后將脫鹽后的蛋白樣品過Resource Q陰離子交換柱，所用緩沖液為：A液(25 mmol/L Tris、1 mmol/L DTT，pH 7.5)、B液(25 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl、1 mmol/L DTT，pH 7.5)。收集含蛋白組分，用SDS-PAGE鑒定，將含有目標蛋白的組分合并，利用AKTA純化儀隨機軟件對洗脫峰進行積分并估算蛋白質(zhì)濃度。

7)目標蛋白的質(zhì)譜分析：從SDS-PAGE膠上切取含有目標蛋白質(zhì)的條帶，經(jīng)膠內(nèi)酶解后，用MALDITOF-TOF質(zhì)譜儀進行分析，運用Mascot軟件將質(zhì)譜結(jié)果在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進行檢索，得出蛋白質(zhì)的可能性分數(shù)，根據(jù)所用蛋白數(shù)據(jù)庫來確定陽性的分數(shù)，從而判定是否為核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A蛋白。

2 結(jié)果

2.1 RpiA表達載體的構(gòu)建

PCR擴增得到了編碼rpiA的DNA片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小與預期的一致。將該片段和pGEX-6p-1載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1 blue，挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定得到陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定，得到陽性克隆，測序結(jié)果證實為核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A蛋白編碼序列。

2.2 誘導表達及蛋白表達形式分析

將rpiA工程菌于37℃、1 mmol/L IPTG的條件下誘導表達20 h，超聲破碎菌體，4℃、1 5000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAG分析。在破菌沉淀中可見相對分子質(zhì)量約為40 000的融合蛋白表達條帶，大小與預期的一致，上清中也含有少量目標蛋白，說明rpiA能夠在大腸桿菌中高效表達，但在37℃誘導條件下，表達產(chǎn)物主要以包含體的形式存在。

2.3 蛋白表達條件的優(yōu)化

1)在培養(yǎng)液 OD600值等于0.8、IPTG濃度0.1 mmol/L條件下，分別在37℃、16℃誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后取破菌上清進行SDS-PAGE，結(jié)果表明16℃時目標蛋白在上清中的表達量較大(圖1)。

圖1 目標蛋白在不同溫度下誘導后的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG at different temperature1：before induction;2：after induction at 16℃;3：16℃ supernatant;4：before induction;5：after induction at 37℃;6：37℃supernatant;M：66 000，46 000，34 000，26 000，16 000; IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside;M：marker.

2)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、16℃條件下，用終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L的IPTG誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后20 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明當IPTG終濃度為0.5 mmol/L、4 mmol/L時目標蛋白的表達量最大(圖2)。

3)在培養(yǎng)液OD600值等于0.8、16℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L條件下誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、20 h取樣SDSPAGE，結(jié)果表明誘導20 h目標蛋白的表達量最大(圖3)。

4)在IPTG終濃度為0.1 mmol/L、16℃誘導條件下，在培養(yǎng)液OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后20 h取樣SDS-PAGE，結(jié)果表明當培養(yǎng)液OD600值為0.6時開始誘導目標蛋白的表達量最大(圖4)。

由上述實驗可知，變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A在大腸桿菌中的最佳表達條件為：培養(yǎng)溫度16℃、開始誘導的培養(yǎng)液OD600值等于0.6、IPTG終濃度0.5 mmol/L、誘導時間20 h。

2.4 蛋白純化

將收集的菌體破碎、離心后，收集上清，進行Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化，得到較高純度的目的蛋白。合并后經(jīng)電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖5)。

圖5 Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化后目標蛋白的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of rpiA eluted from affinity chromatographyM：marker.

利用陰離子交換進一步純化目的蛋白，收集主峰各組分，合并后經(jīng)電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖6)。

2.5 蛋白的質(zhì)譜鑒定

將SDS-PAGE凝膠上的樣品條帶切下進行膠內(nèi)酶切，再進行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索后，結(jié)果為變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A，得分178，是可信的匹配結(jié)果。因此從蛋白水平證實該蛋白為變異鏈球菌核糖-5-磷酸異構(gòu)酶A(圖7)。

3 討論

在磷酸戊糖途徑中，核糖-5-磷酸和核酮糖-5-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的一步。磷酸糖異構(gòu)酶能夠參與催化非磷酸化的醛糖或者酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化，盡管催化效率不如它們自然的磷酸化底物高，至少在核糖-5-磷酸異構(gòu)酶中是如此［8］。由于部分糖類異構(gòu)酶具有廣泛的底物特異性，許多酶比如6-磷酸半乳糖苷酶已經(jīng)用于罕見糖類的異構(gòu)化［9］。這些異構(gòu)酶通過2種不同的異構(gòu)化反應將一種底物轉(zhuǎn)化成2種不同的產(chǎn)物。與這些酶的異構(gòu)化反應所不同的是，核糖-5-磷酸異構(gòu)酶催化糖類的相互轉(zhuǎn)變則只是通過一種異構(gòu)化反應。RpiA和RpiB這2種完全沒有氨基酸序列相似性的酶的催化活性首先在大腸桿菌中被確證，在研究過程中，RpiA被認為是促進生命活動過程中所必須的五碳糖之間的相互轉(zhuǎn)變，而RpiB的主要作用則是促進罕見六碳糖類6-磷酸核糖和6-磷酸核酮糖的相互轉(zhuǎn)化。對于變異鏈球菌RpiA的異構(gòu)化作用及其對于底物的相對特異性選擇則需要通過相關(guān)的動力學特征研究來得到進一步的確證。

RpiA已經(jīng)從至少60個物種中獲得序列并且已經(jīng)在許多有機體中得到了克隆，包括大腸桿菌和菠菜。這些酶之間以及與人類體內(nèi)的酶之間的氨基酸序列均具有30%的同源性。細菌rpiA參與細菌的磷酸戊糖途徑，對細菌的生存至關(guān)重要。變異鏈球菌是重要的致齲菌，但目前缺乏有針對性的治療藥物，對其致齲機制也缺乏深入的了解。尋找新的分子靶標，特別是與其毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)成為目前研究的熱點。通過對這類蛋白功能的進一步研究，有望在分子水平上理解變異鏈球菌的致齲機制，對開發(fā)有針對性的治療藥物或疫苗有極大幫助。

本研究成功地在大腸桿菌中表達了變異鏈球菌rpiA，并建立了高效純化工藝。目前正在進行rpiA結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，探索變異鏈球菌rpiA在致齲方面的作用機制。

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