三氯生水凝膠乳化抗菌劑在兔膝損傷模型血液內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)*

呂曉東，蔡谞，張英

(1.解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853;2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院骨科，濟(jì)南 250031)

感染是骨科手術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。細(xì)菌耐藥性是抗感染治療面臨的難題。近年來三氯生被廣泛應(yīng)用，作為氯化聯(lián)苯醚家族中最常用而且藥效最強(qiáng)的抗菌劑，三氯生對(duì)革蘭陽性菌較革蘭陰性菌更有效，如外科手術(shù)感染的常見菌金黃色葡萄球菌。三氯生在周圍環(huán)境中易降解，不產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，作為國際上推崇的安全、高效、廣譜抗菌藥，相關(guān)數(shù)據(jù)證明三氯生口服安全系數(shù)高，也無明顯致癌性，針對(duì)各種瀕危物種，包括人，三氯生具有良好的生物耐受性［1-4］。但三氯生在作用部位存留時(shí)間不長(4～6 h)，期待開發(fā)一種特殊復(fù)合抗菌藥，能夠在更長的時(shí)間段漸漸地釋放出活性的三氯生，以達(dá)到持久的抗菌效果。凝膠型乳劑在單位時(shí)間內(nèi)有著比較恒定的釋放劑量，以維持血藥濃度恒定。代表現(xiàn)代制劑技術(shù)的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6個(gè)月齡同窩新西蘭大耳白兔，北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，合格證號(hào):xcxk(京)2003-0007);解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心具體實(shí)施，使用許可證號(hào):syxk(軍)2007-009。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Hitachi7170全自動(dòng)生化分析儀(日立公司);Agilent 1100型高效液相色譜分析儀及化學(xué)工作站(惠普公司);安捷倫公司ZOBAX SB-C18分析色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);Tu-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);AL104電子分析天平(梅特勒-托利多):量程20 g，精度0.001 g;Kesp-1000超聲波震蕩器(上海安亭科學(xué)儀器廠);ZH-2自動(dòng)漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);LDZ52微量離心機(jī)(上?？茖W(xué)儀器四廠)。

1.1.3 試藥 三氯生(Triclosan，Ciba Specialty Chemicals，Switzerland，批號(hào):F80028，分析純);醫(yī)用玻璃酸鈉水凝膠(hydrogel acid，日本生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào):8H121Z，規(guī)格:每支2.5 mg);醫(yī)用幾丁糖水凝膠(chitosan，石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司，批號(hào):081012，規(guī)格:每支30 mg);羥化蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL，BASF Group，德國，批號(hào):04061821);甲醇(BASF Group，德國，批號(hào):K37218907-719，分析純，HPLC 級(jí))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?同一批次同時(shí)制備左側(cè)膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎模型。制備方法:實(shí)驗(yàn)性兔麻醉后取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，顯露髕股關(guān)節(jié)面，作直徑4.5 mm，深3 mm鉆孔(深達(dá)軟骨下骨質(zhì))，獲得關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。術(shù)后各組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)不予外固定，自由活動(dòng)。術(shù)后第6天，關(guān)節(jié)囊初步愈合，試注射0.9%氯化鈉溶液至關(guān)節(jié)囊充盈，觀察創(chuàng)面無滲出，觀察創(chuàng)緣無皮下積液。

1.2.2 抗菌乳劑的制備 給藥前24 h配制三氯生乳液，靜置24 h不分層，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，成為三氯生儲(chǔ)備液。方法:因三氯生晶體顆粒較粗大(直徑4μm)，將精確稱量的三氯生粉劑1.0 g置瑪瑙研缽中輕輕研細(xì)，加入羥化蓖麻油聚氧乙烯醚1.12 g，輕輕研磨，使均勻混合，緩慢加入0.9%氯化鈉溶液20 mL，形成乳液，移液管將乳液移送至刻度試管中，0.9%氯化鈉溶液10 mL洗滌研缽及移液管后加入刻度試管，在刻度試管中添加0.9%氯化鈉溶液至總量40 mL，放置超聲震蕩器內(nèi)20 min，混合均勻，得到濃度為25 mg·mL-1的三氯生乳液，靜置24 h不分層，成為滿足試驗(yàn)要求的三氯生儲(chǔ)備液。

給藥前現(xiàn)場制備4種實(shí)驗(yàn)乳劑，分別保留原液2 mL，經(jīng)預(yù)處理后，于給藥后2 h采用高效液相色譜分析測得4種乳劑的回收率。制備方法:準(zhǔn)備4支量程為20 mL的刻度試管(Ⅰ～Ⅳ)，用移液管精確量取三氯生儲(chǔ)備液6 mL添加至刻度試管備用。試管Ⅰ中添加0.9%氯化鈉溶液至總量15 mL。試管Ⅱ中添加玻璃酸水凝膠6 mL后繼續(xù)添加0.9%氯化鈉溶液至總量15 mL。試管Ⅲ中添加幾丁糖水凝膠6 mL后繼續(xù)添加0.9%氯化鈉溶液至總量15 mL?，F(xiàn)場取等量的玻璃酸水凝膠和幾丁糖水凝膠，經(jīng)超聲震蕩10 min混合均勻后得到聚合水凝膠，試管Ⅳ中添加聚合水凝膠6 mL后繼續(xù)添加0.9%氯化鈉溶液至總量15 mL。超聲震蕩20min混合均勻后得到4種乳液，室溫靜置2 h取上清液后用0.9%氯化鈉溶液稀釋250倍，漩渦混合器上充分混勻后取上清液0.25 mL甲醇稀釋4倍，高效液相色譜(HPLC)分析測得回收率。

1.2.3 動(dòng)物分組與造模 同窩新西蘭大耳白兔30只(雌雄各15只)，隨機(jī)分為5組，每組6只(雌雄各3只)。所有動(dòng)物體質(zhì)量均為2.5 kg，每組各取同性別的動(dòng)物1只，組成1個(gè)區(qū)組(包括雄兔5只或雌兔5只)，共得到6個(gè)區(qū)組，同一區(qū)組同時(shí)手術(shù)，術(shù)后置于同一觀察室，喂養(yǎng)及攝食情況無差異，觀察精神狀態(tài)無明顯異常，滿足實(shí)驗(yàn)要求。各區(qū)組同樣在術(shù)后第7天給藥，給藥及采血方式無差異。每1區(qū)組包括5只動(dòng)物，分別來自A、B、C、D、E組，術(shù)后第7天給藥清晨空腹給藥，A、B、C、D組分別給予不同乳劑(Ⅰ～Ⅳ)。E組不給藥，嚴(yán)格要求同時(shí)給藥，組間前后間隔時(shí)間不超過5 min。術(shù)后動(dòng)物自由活動(dòng)，喂養(yǎng)及觀察情況無差異。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，A、B、C、D 組分別于術(shù)后 6，12，24，48，72，96 h在右耳靜脈反復(fù)取血2 mL，測血液三氯生水平。比較4種乳劑關(guān)節(jié)腔注射后，血液三氯生藥物水平和維持時(shí)間。

1.2.4 空白對(duì)照液的配制 E組動(dòng)物的血液2 mL，靜置 24 h后，取上層血清0.4 mL，向血清中添加50μg·mL-1的三氯生溶液0.1 mL，自動(dòng)渦旋混合器充分混合后，取上清液0.2 mL，作為空白對(duì)照液，濃度10 μg·mL-1。

1.2.5 選定標(biāo)準(zhǔn)液 空白對(duì)照液用甲醇稀釋4倍，微量離心機(jī)4℃下12 000×g離心10 min，以濃度10μg·mL-1的三氯生溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，測得空白對(duì)照液三氯生的回收率為95.8% ～96.9%，日間RSD為3.5%。使用空白對(duì)照液作為標(biāo)準(zhǔn)液測量各標(biāo)本。

1.2.6 標(biāo)本的制備 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均取血液2 mL靜置24 h，取上清液0.25 mL，甲醇稀釋4倍至1 mL，微量離心機(jī)4℃下12 000×g離心10 min，取上清液0.2 mL，進(jìn)行HPLC分析。測得標(biāo)本吸收峰，與三氯生標(biāo)準(zhǔn)液比對(duì)后得到標(biāo)本的三氯生濃度，計(jì)算血清內(nèi)三氯生濃度。

1.2.7 HPLC分析 色譜條件:ZOBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水緩沖液(80∶20)，流速 1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量 40 μL，壓強(qiáng)1.20×104kPa，標(biāo)準(zhǔn)液為10μg·mL-1空白對(duì)照液。

1.2.8 空腹血糖的測定 A、B、C、D、E組于給藥前，給藥后24，48，72，96 h 在左耳靜脈反復(fù)取血 2 mL，置氟化鈉抗凝管，以Hitachi 7170全自動(dòng)生化分析儀測得空腹血糖。計(jì)算各組給藥前后空腹血糖變化的差值。①與給藥前比較，計(jì)算給藥后每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)血糖升高或降低的情況，得到血糖升高和降低的最大值和平均值;②將各組血糖升高(血糖降低)的情況匯總，得到最大值、平均值的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差;③各組與空白對(duì)照組比較，計(jì)算注射乳劑與不注射乳劑比較空腹血糖變化的差異;④4種乳劑比較，空腹血糖變化的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行處理，血液三氯生峰濃度，血液三氯生平均濃度的比較采用F檢驗(yàn)?？崭寡巧咦畲笾?、平均值，空腹血糖降低最大值、平均值的比較采用多組比較的秩和檢驗(yàn)Kruskal-Wailis H檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)乳劑的回收率 結(jié)果見表1。

表1 4種乳劑的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 The recovery and precision of four kinds of emulsions %

2.2 血液三氯生濃度 結(jié)果見表2。峰濃度和平均濃度按正態(tài)分布計(jì)量統(tǒng)計(jì)資料進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析。方差分析得出:①對(duì)照組三氯生水平顯著高于其他各組(P＜0.05);②在玻璃酸組，幾丁糖組和聚合水凝膠組中，玻璃酸組三氯生水平最低，聚合水凝膠組三氯生水平最高，三者之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

2.3 各組血液三氯生維持時(shí)間比較 各組血液內(nèi)均檢測到三氯生，對(duì)照組和聚合水凝膠組的維持時(shí)間較短，短于玻璃酸組和幾丁糖組。見圖1。

2.4 空腹血糖濃度變化差異 結(jié)果見表3。

3 討論

3種水凝膠中的三氯生膠團(tuán)均可以分成兩個(gè)部分，被水凝膠包裹的三氯生膠團(tuán)(包括被重新釋放的和不能被釋放的)，不被水凝膠包裹的自由三氯生膠團(tuán)。自由三氯生膠團(tuán)微粒運(yùn)動(dòng)較活躍，易于黏附關(guān)節(jié)囊壁。三氯生分子被黏膜組織回吸收入血，三氯生釋放入血的量受到自由三氯生膠團(tuán)數(shù)量的直接影響，而受到被水凝膠包裹的三氯生膠團(tuán)數(shù)量的間接影響，可以看作是儲(chǔ)存和緩釋的過程。而這種緩釋過程，在不同的水凝膠其差別非常大。

表2 4種乳劑在各時(shí)間點(diǎn)測得血液的三氯生濃度Tab．2 The blood concentration of triclosan at different time points after injection of four kinds of emulsions mg·mL-1±s

表2 4種乳劑在各時(shí)間點(diǎn)測得血液的三氯生濃度Tab．2 The blood concentration of triclosan at different time points after injection of four kinds of emulsions mg·mL-1±s

與對(duì)照組比較，*1 P＜0.05;與幾丁糖組和聚合水凝膠組比較，*2 P＜0.05;與幾丁糖組比較，*3 P＜0.05Compared with control group，*1 P ＜0.05;Compared with chitosan emulsions group and polymer hydrogelgroup，*2 P ＜0.05;Compared with chitosan emulsions group，*3 P ＜0.05

組別 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h 峰濃度 平均濃度玻璃酸組 7.365±0.624 13.532±1.04722.172±1.146 20.854±1.346 9.831±1.086 7.206±1.375 22.172±1.146*1*2 13.525±1.385*1*2幾丁糖組 10.163±1.174 18.014±1.68127.735±2.124 18.675±1.248 12.363±1.360 5.164±2.124 27.735±2.124*1 15.352±1.837*1聚合水凝膠組 30.325±1.215 33.637±1.06213.726±1.428 4.684±0.973 ＜0.5 ＜0.5 33.637±1.062*1*3 20.593±1.346*1*3對(duì)照組 23.553±1.207 41.375±1.80625.486±1.456 6.756±0.845 ＜0.5 ＜0.5 41.375±1.806 24.295±1.556

對(duì)照組的三氯生膠團(tuán)全部是自由三氯生膠團(tuán)，沒有被儲(chǔ)存和緩釋。直接釋放入血，因此血液中三氯生的維持時(shí)間短，峰濃度和平均濃度最高。

聚合水凝膠易于結(jié)合三氯生膠團(tuán)，難于釋放它們。但這種不可逆結(jié)合的量是有限的。雖然聚合物水凝膠釋放入血的三氯生的絕對(duì)量減少，血液中三氯生的維持時(shí)間短，但峰濃度和平均濃度仍然高于玻璃酸組和幾丁糖組。

表3 5組空腹血糖的變化Tab．3 Changes of fasting p lasma glucose in five groups mmol·L-1±s

表3 5組空腹血糖的變化Tab．3 Changes of fasting p lasma glucose in five groups mmol·L-1±s

與對(duì)照組和聚合水凝膠組比較，*1 P＜0.05Compared with control group and polymer hydrogel group，*1 P ＜0.05

組別 血糖升高最大 平均血糖降低最大 平均玻璃酸組 0.661±0.018*1 0.353±0.018*1 0.751±0.018*1 0.351±0.018*1幾丁糖組 0.703±0.155*1 0.346±0.045*1 0.803±0.155*1 0.346±0.045*1聚合水凝膠組 1.034±0.067 0.614±0.085 1.601±0.137 0.605±0.079空白對(duì)照組 0.624±0.155*1 0.364±0.055*1 0.813±0.155*1 0.386±0.045*1對(duì)照組 1.501±0.137 0.746±0.108 1.026±0.067 0.663±0.112

玻璃酸組和幾丁糖組的三氯生膠團(tuán)可以看作兩部分:自由釋放部分和緩釋部分，兩者相比，玻璃酸吸水性強(qiáng)，且對(duì)環(huán)境變化敏感，緩釋作用強(qiáng)于幾丁糖凝膠，因此玻璃酸組血液中三氯生的峰濃度和平均濃度低于幾丁糖水凝膠組。

近年來，人們認(rèn)識(shí)到三氯生是通過與細(xì)菌脂肪酸合成酶系中烯?；d體蛋白還原酶(enoylacyl carrier protein reductase，EACPR)相互作用，抑制脂肪酸的合成而起抗菌作用，有關(guān)其對(duì)細(xì)菌脂肪代謝作用的研究文章也陸續(xù)發(fā)表［5-11］。碳水化合物與脂肪相互轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)過程是機(jī)體血糖濃度賴以穩(wěn)定的重要機(jī)制，生物體內(nèi)兩大供能物質(zhì)脂肪與碳水化合物之間存在著一種平衡關(guān)系，一旦脂肪合成受到抑制，勢(shì)必對(duì)碳水化合物的代謝產(chǎn)生影響［12-15］。本研究證實(shí)，三氯生對(duì)兔碳水化合物代謝有影響，并且這種影響與血液中三氯生水平的變化存在聯(lián)系，需要進(jìn)一步研究。

由于玻璃酸和幾丁糖的水凝膠具有緩釋作用，血液中三氯生的濃度波動(dòng)小，可能是玻璃酸和幾丁糖組空腹血糖變化不明顯的原因。通過本實(shí)驗(yàn)可以得出，與三氯生乳劑和三氯生聚合水凝膠乳劑比較，三氯生玻璃酸乳劑和三氯生幾丁糖乳劑血中三氯生平均濃度較低，空腹血糖水平無明顯異常，并且三氯生玻璃酸糖乳劑和三氯生幾丁糖乳劑相比，關(guān)節(jié)腔藥物有效濃度無差異，血液藥物濃度水平更低，空腹血糖水平無明顯異常，玻璃酸組和幾丁糖組血液三氯生維持時(shí)間比較長，更適于臨床應(yīng)用。

［1］ WOLFE SW，SWIGART C R，GRAUER J，et al.Augmented external fixation of distal radius fractures:a biomechanical analysis［J］.J Hand Surg，1998，23A:127-134.

［2］ WOLFE SW，AUSTIN G，LORENZE M，et al.A biomechanical comparison of different wrist external fixators with and without K-wire augmentation［J］.J Hand Surg Am，1999，24:516-524.

［3］ NAIDU S H，CAPO J T，MOULTON M，et al.Percutaneous pinning of distal radius fractures:a biomechanical study［J］.JHand Surg，1997，22A:252-257.

［4］ SAEKI Y，HASHIZUME H，NAGOSHIM，et al.Mechanical strength of intramedullary pinning and transfragmental kirschner wire fixation for colles’fractures［J］.JHand Surg Br，2001，26B:550-555.

［5］ CHERNG A，TAKAGI S，CHOW C.Effects of hydroxypropyl methylcellulose and other gelling agents on the handling properties of calcium phosphate cement［J］.J Biomed Mater Res，1997，35(2):273-277.

［6］ TAKECHIM，MIYAMOTO Y，ISHIKAWA K，etal.Effects of added antibiotics on the basic properties of antiwashout-type fast-setting calcium phosphate cement［J］.J Biomed Mater Res，1998，39(2):308-316.

［7］ ISHIKAWA K，MIYAMOTO Y，KONM，etal.Non-decay type fast-setting calcium phosphate cement:composite with sodium alginate［J］.Biomaterials，1995，16(7):527-532.

［8］ GOODMAN SB，BAUER TW，CARTER D，etal.Norian SRS cement augmentation in hip fracture treatment:laboratory initial clinical results［J］.Clin Orthop，1998，345:42-50.

［9］ LARSSON S，MATTSSON P，BAUER TW.Resorbable bone cement for augmentation of internally fixed hip fractures［J］.Ann Chir Gynaecol，1999，88:205-213.

［10］ KIYOSHIGE Y，TAKAGIM，HAMASAKIM.Bonecement fixation for calcaneus fracture:a report on 2 elderly patients［J］.Acta Orthop Scand，1997，68(4):408-409.

［11］ HUSBAND J，CASSIDY C，LEINBERRY C，et al.Mylticenter clinical trial of Norian SRS versus conventional therapy in treatment of distal radius fractures［J］.Trans Am Acad Orthop Surg，1997，64:212.

［12］ HIDAKA N，YAMANO Y，KADOYA Y，etal.Calcium phosphate bonement for treatment of radius fractures:a preliminary report［J］.J Orthop Sci，2002，7(2):182-187.

［13］ KOPYLOV P，ADALBERTH K，JONSSON K，et al.Norian SRS functional treatment in redisplaced distal radial fractures:a randomized study in 20 patients［J］.J Hand Surg，2002，27B(6):538-541.

［14］ ERIKSSON F，MATTSSON P，LARSSON S.Effect of augmentation with resorbable or conventional bone cement on the holding strength for femoral neck fracture devices［J］.J Orthop Trauma，2002，16(5):302-310.

［15］ MATTSSON P，LARSSON S.Augmentation of femoralmeck fracture fixation with resorbable cement(Norian SRS)and its effect on early postoperative stability measured with RSA［J］.Acta Orthop Scand，2000，70(Suppl287):59.