豬乙型腦炎疫苗的研究進展

秦紅剛，肖 敏，李 偉，謝紅玲，漆世華，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

乙型腦炎又稱日本腦炎(Japenese Epcephalitis B)是一種嗜神經性蟲媒病毒乙型腦炎病毒(Japenese Epcephalitis Virus，JEV)引起的人獸共患傳染病，引起人類的腦炎，對豬的致死率不高，但能引起懷孕母豬發(fā)生流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，公豬發(fā)生睪丸炎［1］。乙型腦炎病毒通常在蚊－豬－蚊等動物間循環(huán)，豬是乙型腦炎病毒最重要的自然增殖動物，是主要的傳染源。因此對豬乙型腦炎的防控具有重要的公共衛(wèi)生學意義。疫苗的免疫接種是目前防控豬乙型腦炎的重要手段，本文就豬乙型腦炎疫苗的研究現(xiàn)狀做一個簡要的綜述。

1 常規(guī)疫苗

臨床上常用的豬乙型腦炎疫苗有鼠腦滅活苗和減毒活疫苗兩種，現(xiàn)分別簡述如下:

1．1 滅活疫苗 鼠腦滅活疫苗于上世紀50年代在日本研究成功，是當前惟一獲得世界衛(wèi)生組織批準并用于商品化出售的人用乙型腦炎疫苗。目前鼠腦滅活苗已經準許在中國、日本、印度、朝鮮、韓國、泰國等地生產和使用，其中美國、加拿大等國家使用的是日本BIKEN公司生產商品名為JEVAX［2］。泰國、印度、越南、朝鮮和馬來西亞等乙型腦炎高度流行的國家使用該疫苗后，有效的降低了乙型腦炎的感染率［3］。鼠腦滅活疫苗免疫效果確實，且安全可靠。

我國最早研制成功的豬乙型腦炎疫苗即為鼠腦滅活疫苗，1996年獲得新獸藥注冊證書，研制單位是湖北省農科院畜牧獸醫(yī)研究所。該單位從流產胎豬腦內分離出的一株豬乙型腦炎強毒WH－1株，腦內接種7～9 g的小鼠，收獲發(fā)病小鼠的腦組織，過濾、滅活、乳化等工藝制成疫苗。該疫苗對各類豬群，尤其是對青年妊娠母豬和公豬的安全性好，免疫接種后無異常反應，無病毒血癥及胎內感染，對豬乙型腦炎引起母豬繁殖障礙保護率高［4］。

1．2 減毒活疫苗 豬乙型腦炎減毒活疫苗是湖北省農科院畜牧獸醫(yī)研究所研制。生產毒株SA14－14－2由中國藥品生物制品檢定所采用分離自蚊幼蟲的SA14株乙型腦炎病毒進行傳代、噬斑篩選得到［5］。用該毒株接種地鼠腎原代細胞培養(yǎng)，收獲病毒培養(yǎng)液，加適宜的穩(wěn)定劑，經冷凍真空干燥制成疫苗。該減毒活疫苗具有可靠的安全性、良好的免疫原性。用后備母豬進行免疫原性試驗，能產生良好的免疫應答;免疫該疫苗的初產母豬能抵抗JEV強毒的攻擊，不產生病毒血癥，對胎兒感染的保護率達100%［6］。該疫苗的質量標準已經收錄入2010版《中國獸藥典》。但由于地鼠腎原代細胞基質無法獲得WHO的認證，此種疫苗尚未在國際上使用。

2 新型疫苗

盡管上述兩種常規(guī)疫苗在豬乙型腦炎的防控中發(fā)揮了重要作用，但鼠腦滅活疫苗生產成本相對較高，減毒活疫苗本身存在毒力返強的危險，人們有必要開發(fā)新型豬乙型腦炎疫苗。

2．1 重組活載體疫苗 乙型腦炎病毒和豬瘟病毒屬于黃病毒科的成員，其基因結構具有一定的同源性，因此可以通過反向遺傳學技術將其中一種病毒結構蛋白的基因替換另一種病毒的結構基于構建嵌合病毒。Yang Z等［7］將截短的JEV E基因代替豬瘟病毒的E基因，構建了反向互補的乙型腦炎－豬瘟嵌合復制子病毒顆粒(CSF－JE virus replicon particle，CSF－JE VRP)。用 CSF－JE VRP免疫小鼠后能夠誘導乙型腦炎特異性抗體，并能抵抗JEV強毒的攻擊;免疫豬后能夠同時誘導強烈的抗乙型腦炎和豬瘟病毒的抗體，為開展豬乙型腦炎豬瘟二聯(lián)基因工程疫苗的研究奠定了基礎。

賽諾菲巴斯德公司以黃病毒17D株為載體，用乙型腦炎病毒SA14－14－2株prM和E基因代替黃病毒17D的prM和E基因，構建成功了黃熱乙型腦炎嵌合病毒。三期臨床證明，其安全性與接種安慰劑組相當，而優(yōu)于鼠腦滅活疫苗，一次單劑量接種血清抗體轉陽率為99．1%［8］。該疫苗已經在澳大利亞注冊成功［9］。此外，還有用痘病毒和偽狂犬病毒作為載體的，但均處于實驗室研究階段。

2．2 亞單位疫苗 JEV E基因具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗研究的首選靶蛋白。Xu XG等［10］構建重組桿狀病毒表達JEV E蛋白，用表達的蛋白免疫小鼠和豬，可以誘導JE特異性中和抗體，保護小鼠和豬免受JEV的攻擊。

乙型腦炎病毒樣顆粒疫苗在生產過程中可避免乙型腦炎病毒的操作，避免了生物安全隱患，又具有良好的免疫原性，是一種較理想的疫苗形式。JEV結構蛋白(prM/M和E)在載體病毒感染或由表達M、E蛋白的真核表達載體轉染的細胞培養(yǎng)物中可以自身裝配成病毒樣顆粒。Kojima等［11］構建了基于Beijing－1毒株的prM－E蛋白編碼基因的真核表達載體，篩選穩(wěn)定表達E蛋白的細胞克隆，將表達的E蛋白免疫小鼠，7個月后仍保持高滴度的中和抗體，用JEV強毒對小鼠進行攻擊后，保護率為100%，使得病毒樣顆粒成為乙型腦炎疫苗研究的重要思路。

2．3 DNA疫苗 DNA疫苗是將抗原基因重組到真核表達載體，注入體內表達出相應抗原，誘導機體產生免疫應答。Konishi E構建了兩株基于prM和E基因的DNA疫苗，以100～450μg劑量間隔3周對豬進行二次免疫。二疫后第1周即產生1∶40～1∶160的中和抗體和血凝抑制抗體，而且高水平的血凝抑制抗體能夠維持 245 d［12］。Zhang Y 等［13］又發(fā)現(xiàn)對E蛋白的N154糖基化位點進行突變后，能夠增強該DNA疫苗對小鼠誘導的體液免疫反應。

3 豬乙型腦炎疫苗的發(fā)展方向

3．1 開展組織細胞培養(yǎng)豬乙型腦炎疫苗的研究

鼠腦滅活苗是由鼠腦組織制備的，疫苗的生產必須經過每只小鼠的腦內接種，感染鼠腦的收獲，操作過程繁瑣，難以形成工業(yè)化生產規(guī)模。隨著地鼠腎細胞苗的誕生，標志乙型腦炎疫苗由組織苗向細胞苗發(fā)展，SA14－14－2株活疫苗生產工藝簡單，成本低廉，但是原代地鼠腎細胞難以杜絕外源因子的污染。為此，人們又采用傳代細胞Vero細胞為基質制備疫苗，Vero細胞具有胞核學穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性，而且研究表明，乙型腦炎病毒對Vero細胞比較敏感，不需要傳代適應，P3株10代以內免疫原性不會降低［14］。目前Vero細胞人用乙型腦炎滅活苗已經在美國、加拿大、以色列、中國等多個國家注冊使用［15］?？梢哉f人用乙型腦炎疫苗的發(fā)展經歷了動物組織苗、原代細胞苗和傳代細胞苗的發(fā)展歷程。豬乙型腦炎疫苗的生產還處于組織苗和原代細胞苗的階段。隨著豬乙型腦炎防控的需要，豬乙型腦炎組織細胞培養(yǎng)疫苗的研究也會越來越被人們所重視。目前我公司在現(xiàn)有的鼠腦滅活苗的基礎上，正積極開展豬乙型腦炎Vero細胞滅活疫苗的研究，期望在不久的將來為我國豬乙型腦炎的防控提供一種新型疫苗。

3．2 開展豬乙型腦炎基因工程疫苗的研究 基因工程疫苗是當前分子生物學、分子免疫學發(fā)展的產物，包括DNA疫苗、重組活載體疫苗、基因工程亞單位疫苗等，是獸用疫苗發(fā)展的一個重要方向。目前已有數(shù)個產品在田間應用，如禽流感－新城疫重組二聯(lián)活疫苗(rL－H5株)［16］;雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT－013－69株)［17］等。在豬乙型腦炎疫苗的研究方面，盡管人們在重組活載體疫苗［7］、DNA 疫苗［12－13］等方面做了很多的基礎性的工作，但均處于實驗室研究階段，應用到臨床還有大量的工作要做。隨著對豬乙型腦炎致病機制研究的深入，研制豬乙型腦炎基因工程疫苗將成為預防豬乙型腦炎重要的發(fā)展方向。

3．3 開展豬乙型腦炎疫苗新生產工藝研究 疫苗的生產工藝是決定疫苗安全性、質量穩(wěn)定性的關鍵因素。乙型腦炎疫苗的發(fā)展也伴隨著生產技術的提升，也是疫苗有效性、安全性、穩(wěn)定性不斷提升的過程。鼠腦滅活苗產量有限，疫苗的生產屬于純手工操作，工業(yè)化生產受到限制。而Vero細胞作為傳代細胞，適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)。Keishin Sugawara等采用生物反應器微載體懸浮培養(yǎng)技術，建立了500L的Vero細胞乙型腦炎滅活疫苗生產體系［18］，真正實現(xiàn)了生產的工業(yè)化自動化控制?？梢灶A見的是生物反應器微載體生產工藝將會逐漸成為主流生產工藝，替代手工操作的生產工藝。

粗制疫苗含有異源蛋白和亞細胞成分，免疫后會引起副反應，而濃縮純化抗原可以提高疫苗免疫效果、降低副反應。為此，人用乙型腦炎疫苗采用了抗原的超濾濃縮純化工藝，并將牛血清白蛋白殘留量、宿主細胞DNA和蛋白質殘留量納入質量標準［19］。目前豬乙型腦炎疫苗均為粗制疫苗，純化工藝還沒有被應用。但隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高品質純化疫苗會有更多市場需求，純化工藝研究和應用會越來越來普遍。

4 結語

盡管豬乙型腦炎疫苗的研究已經取得一定的進展，但目前用于臨床的還是鼠腦滅活疫苗和減毒活疫苗兩種傳統(tǒng)疫苗。相信隨著對豬乙型腦炎研究的深入，人們終將研究出更為安全、有效、經濟、實用的豬乙型腦炎疫苗。

［1］ 殷 震，劉景華．動物病毒學(第2版)［M］．北京:科學出版社，1997:631 －640．

［2］ Kollaritsch H，Pau lke－Korinek M，Dubischar－Kastner K．Japanese encephalitis vaccine［J］．Expert Opin Biol Ther 2009，9:921 －931．

［3］ Scott B．Halstead，Stephen J．Thomas．Jepanese Encephalitis:New options for active immunization ［J］．Clin Infect Dis．2010，50(8):1155－1164．

［4］ 方雨玲，姜天童，徐滌平．乙型腦炎油乳劑滅活疫苗的研制與應用綜合報告［J］．湖北畜牧獸醫(yī)．1996，1:1 －3．

［5］ 俞永新．流行性乙型腦炎減毒活疫苗的發(fā)展和應用［J］．上海預防醫(yī)學雜志．2006，18(3):110 －112．

［6］ 徐滌平，劉澤文，楊宜生等．豬乙型腦炎減毒活疫苗的安全性和免疫原性試驗［J］．中國獸藥雜志．2002，36(8):20 －22．

［7］ Yang Z，W u R，Li RW，et al．Chimeric classical swine fever(CSF)－Japanese encephalitis(JE)viral replicon as a nontransmissible vaccine candidate against CSF and JE infections［J］．Virus Res．2012，165(1):61 －70．

［8］ Torresi J，McCarthy K，F(xiàn)eroldi E，Meric C．Immunogenicity，safety and tolerability in adults of a new single－ dose，live attenuated vaccine against Japanese encephalitis:randomised controlled Phase3trials［J］．Vaccine．2010，28(50):7993 – 8000．

［9］ FischerM，LindseyN，StaplesJE，etal．Japaneseencephalitisvaccines:recommendationsoftheAdvisoryCommitteeonImmunization Practices(ACIP)［J］．MMWRRecomm．Rep．2010，59:1 – 27．

［10］ XuXG，WangZS，ZhangQ，etal．Baculovirussurfacedisplayof EenvelopeglycoproteinofJapaneseencephalitisvirusandits immunogenicityofthedisplayedproteinsinmouseandswine models［J］．Vaccine．2011，29(4):636 －643．

［11］ KojjmaA，YasudaA，AsanumaH，etal．Stablehigh － producer cellcloneexpressingvirus－likeparticlesoftheJapaneseencephalitisvirusEproteinforasecond－generationsubunitvaccine［J］．JVirol．2003，77:8745 －8755．

［12］ KonishiE，YamaokaM，KuraneI，etal．Japaneseencephalitis DNAvaccinecandidatesexpressingpremembraneandenvelope genesinducevirus－specificmemoryBcellsandlong－lasting antibodiesinswine［J］．Virology．2000，268(1):49 －55．

［13］ ZhangY，ChenP，CaoR，etal．MutationofputativeN － linked glycosylationsitesinJapaneseencephalitisviruspremembrane andenvelopeproteinsenhanceshumoralimmunityinBALB/C miceafterDNAvaccination［J］．VirolJ．2011，8:138 －145．

［14］鹿成華，楊抗抗，常振彥，等．乙型腦炎滅活疫苗Vero細胞適應毒種的研究［J］．中國生物制品學雜志．1997，10(1):83 －85．

［15］ SrivastavaAK，PutnakJR，LeeSH，etal．Apurifiedinactivated JapaneseencephalitisvirusvaccinemadeinVerocells［J］．Vaccine．2001，19:4557 – 4565．

［16］寧宜寶．獸用疫苗學［M］．中國農業(yè)出版社，2008:336－344．

［17］中華人民共和國農業(yè)部公告第1348號．

［18］ KeishinS，KiyotoN，YujiI，etal．DevelopmentofverocellderivedinactivatedJapaneseEncephalitisvaccine［J］．Biologicals．2002，30:303 –314．

［19］國家藥典委員會，中華人民共和國藥典(2010版三部)［S］．中國醫(yī)藥科技出版社．2010:91－93．