益氣散聚方的水提醇沉工藝研究

李天辰，沈侃，韓偉*

(1.華東理工大學中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237;2.上海中藥制藥技術有限公司，上海200042)

代謝綜合征是高血壓、血糖異常、血脂紊亂和肥胖癥等多種疾病在人體內集結的一種狀態(tài)，直接導致嚴重心血管疾病的發(fā)生，嚴重時可造成死亡［1］。世界衛(wèi)生組織把一個人身上出現(xiàn)高血壓、高血脂、肥胖、高胰島素血癥等多種病理狀態(tài)集結的疾病，統(tǒng)稱為“代謝綜合征”［2］。作為一種多病因、多組成、多表現(xiàn)、多危害的特異性癥候群，代謝綜合征成為心腦血管疾病、糖尿病、痛風、腫瘤等諸多疾病的共同病理基礎［3］。

益氣散聚方是治療代謝綜合征的臨床經驗方，該方能有效地降低患者的胰島素抵抗，控制機體的糖代謝混亂，并有效地降低患者的血脂，體質量和腰臀圍［4］。益氣散聚方的處方由黃芪、蒲黃、澤瀉、茵陳、黃連五味藥物組成。其中，黃芪作為藥物中的君藥，在利尿降壓，降低心肌負荷，改善心功能方面發(fā)揮著重要的作用［5-6］。為了將益氣散聚方從傳統(tǒng)的水煎劑開發(fā)為現(xiàn)代中藥制劑，本實驗運用正交實驗法以黃芪甲苷轉移率和干浸膏得率為指標，以提取時間、提取次數(shù)、加水倍數(shù)為考察因素優(yōu)化水提工藝;以藥液相對密度、醇沉時間、醇沉濃度為考察因素，優(yōu)化醇沉工藝。

1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀、2000ES蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech)、超純水設備(上海賽鴿電子有限公司)、εlma 890/H超聲清洗器(德國)、R-501旋轉蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術有限公司)、W501型升降恒溫水浴鍋、TC-15套式恒溫器(新華醫(yī)療器械廠)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)、TDL-5-A型離心機(上海安亭儀器廠)。

黃芪甲苷對照品(購自中國藥品生物制品鑒定所，批號為110781-200613)、氨試液、甲醇、磷酸、95%乙醇、正丁醇(分析純)、自制色譜純水。甲醇，乙腈(品牌:J＆K，色譜純)。黃芪藥材(批號為101123，含黃芪甲苷0.11%，產地:甘肅)、茵陳藥材(批號101101，產地:陜西)、澤瀉藥材(批號101318，產地:福建)、黃連藥材(批號101019，產地:四川)、蒲黃藥材(批號101703，產地:內蒙古)。

2 實驗方法

2.1 色譜條件與適用性試驗資生堂C18色譜柱(4.6 mm I.D.×150 mm，5 μm);檢測器為ELSD(102℃，2.7 L/min);乙腈-水(32∶68)為流動相;柱溫為30℃;理論塔板數(shù)以黃芪甲苷計算應該不低于4 000。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇制成質量濃度為0.54 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備按照藥材配比，稱取藥材，水提并將提取液置旋轉蒸發(fā)儀中濃縮(若醇沉，則加入乙醇，并靜置)，離心過濾取上清液，而后置105℃恒溫干燥箱中烘干制成浸膏。

取1 g浸膏粉于蒸發(fā)皿中，精密加入50 mL甲醇，超聲2 h，過濾，濾液蒸干，加水20 mL復溶，用水飽和的正丁醇萃取，每次40 mL，共4次，合并正丁醇液，之后用40%的氨水洗滌兩次，每次80 mL，取有幾層，棄去下層，蒸干，緩慢加入甲醇復溶，并定容至5 mL，過微孔濾膜，進液相測定，進樣量為10 μL。

2.4 線性關系考察精密稱取黃芪甲苷對照品適量，分別制成質量濃度為0.027、0.054、0.108、0.27、0.54、1.08 mg/mL的標準溶液，過0.45 μm微孔濾膜后，進液相測定，進樣量為10 μL，測定峰面積值。以峰面積的自然對數(shù)為橫坐標X，進樣質量的自然對數(shù)為縱坐標Y，計算回歸方程:Y=0.587 2X－3.936 2，r=0.999 8。結果表明黃芪甲苷對照品在0.27～10.8 μg范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗精密吸取0.54 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復6次記錄峰面積，結果其RSD為2.07%。

2.6 穩(wěn)定性試驗分別于0、2、4、8、16、24 h精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(質量濃度為0.54 mg/mL)10 μL注入液相色譜儀，記錄黃芪甲苷峰面積，計算，結果RSD為0.85%，表明黃芪甲苷在24 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗將批號為20120408水提醇沉浸膏樣品制成供試品溶液，測定，計算得黃芪甲苷的平均質量分數(shù)為1.45 mg/g，RSD為1.56%。

2.8 回收率試驗采用加樣回收率方法。取同一批樣品共9份，每份約1 g(批號20120408，含黃芪甲苷1.45 mg/g)，精密稱定，分3組，分別精密加入質量濃度為0.27、0.54、1.08 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液5 mL，照供試品溶液的制備項下方法制備成供試品溶液，測定，計算得平均回收率為99.01%，RSD為2.15%(n=9)。

2.9 樣品的測定精密稱取正交實驗浸膏樣品，照供試品溶液的制備項下方法制備成供試品溶液，進樣測定。每份樣品測定兩次，按回歸方程計算，以兩次測定的平均值作為測定值，計算樣品中黃芪甲苷的含有量。

3 正交實驗優(yōu)化設計與統(tǒng)計分析

3.1 水提工藝正交實驗設計以加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以黃芪甲苷的轉移率，出膏率為考察指標，以設計L9(34)正交表，按照正交表進行提取實驗，每一份實驗重復兩次。水提工藝正交實驗因素水平見表1，水提取工藝正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3和表4。

表1 水提正交實驗因素水平

表2 水提正交實驗結果

表3 水提轉移率方差分析

表4 水提出膏率方差分析

考慮黃芪甲苷的轉移率，其極差R的大小順序依次為提取次數(shù)(C)＞提取時間(A)＞加水倍數(shù)(B)，得出影響黃芪甲苷轉移率的因素大小順序是C＞A＞B。

考慮干浸膏的得率，其極差R的大小順序依次為提取次數(shù)(C)＞加水倍數(shù)(B)＞提取時間(A)，即得出影響干浸膏得率因素大小順序是C＞B＞A。

從方差分析來看:從轉移率角度出發(fā)，提取次數(shù)(C)、加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)對于黃芪甲苷轉移率都有著統(tǒng)計學的意義。從浸膏率角度出發(fā)，提取次數(shù)(C)對于出膏率有統(tǒng)計學意義，而加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)則意義不大。

3.2 水提工藝綜合評分設計由于本水提工藝實驗由轉移率和浸膏率兩個指標組成，兩個指標判斷標準不一，所以決定采取加權評分法進行綜合評判。方法如下:轉移率最高得100分，最低得0分，以轉移率為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=2.116 85X－39.098 22，分別將正交表中的各個轉移率代入，得到相應的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=－6.940 27X+205.281 44，分別將正交表中的各個浸膏率代入，得到相應的分值。綜合評分=轉移率得分×0.6+浸膏率得分×0.4。水提綜合評分結果見表5，方差分析見表6。

表5 水提綜合評分結果

表6 水提綜合評分方差分析

從綜合評分角度來分析，根據其極差大小來看，其影響因素順序為提取次數(shù)(C)＞加水倍數(shù)(A)＞提取時間(B)，比較各個因素不同水平結果的加和值，對于因素C，其優(yōu)劣次序為3＞2＞1，對于因素A，其優(yōu)劣次序為2＞3＞1，對于因素B，其優(yōu)劣次序為3＞1＞2。

從其方差分析來看，由于F0.05(1，2)=19，提取次數(shù)(C)相對于加水倍數(shù)(A)和提取時間(B)有著統(tǒng)計學意義。

綜合考慮，決定采用綜合評分所得到的結果，選擇A2B3C3作為最優(yōu)提取方案。即提取3次，每次加8倍量水，每次提取2 h。

3.3 水提工藝正交實驗的驗證按處方比例稱取15倍量藥材3份，根據正交優(yōu)化過的提取方案，提取3次，每次加8倍量的水，每次提取2 h，合并藥液，減壓濃縮并至105℃恒溫干燥箱中干燥3 h。驗證結果見表7。

提取實驗雖然經過了優(yōu)化，但其出膏率偏大，黃芪甲苷轉移率偏低，普遍小于60%，需要通過醇沉實驗去除其中的雜質，降低出膏率，提高轉移率。

表7 水提實驗驗證結果

3.4 醇沉工藝正交實驗設計以藥液相對密度、醇沉濃度、醇沉時間為考察因素，以黃芪甲苷轉移率、出膏率為指標，采用L9(34)正交表，按正交表進行醇沉實驗，每個實驗重復兩次。見表8，表9，方差分析結果見表10，表11。

表8 醇沉正交實驗因素水平

表9 醇沉正交實驗結果

表10 醇沉轉移率方差分析

表11 醇沉出膏率方差分析

從直觀分析來看，考慮黃芪甲苷的轉移率，其極差R的大小順序依次為藥液相對密度(A)＞醇沉濃度(B)＞醇沉時間(C)，得出影響黃芪甲苷轉移率的因素大小順序是A＞B＞C。

考慮干浸膏的得率，其極差R的大小順序依次為A＞B＞C，得出影響干浸膏得率因素大小順序是A＞B＞C。

從方差分析來看:F0.05(2，2)=19，三者均無統(tǒng)計學影響。

3.5 醇沉工藝綜合評分設計由于本水提工藝實驗由轉移率和浸膏率兩個指標組成，兩個指標判斷標準不一，所以決定采取加權評分法進行綜合評判。方法如下:轉移率最高得100分，最低得0分，以轉移率為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=2.848 19X－83.138 71，分別將正交表中的各個轉移率代入，得到相應的分值。浸膏率最低得100分，最高得0分，以浸膏率為橫坐標，得分為縱坐標，將最高最低兩點代入，得直線方程Y=－16.638 94X+193.677 20，分別將正交表中的各個浸膏率代入，得到相應的分值。綜合評分=轉移率得分×0.6+浸膏率×0.4。醇沉綜合評分結果見表12，方差分析見表13。

表12 醇沉綜合評分結果

從綜合評分角度來分析，其影響因素順序為醇沉濃度(B)＞藥液相對密度(A)＞醇沉時間(C)，比較各個因素不同水平結果的加和值，對于因素B，其優(yōu)劣次序為3＞2＞1，對于因素A，其優(yōu)劣次序為2＞3＞1，對于因素C，其優(yōu)劣次序為1＞3＞2，即最優(yōu)方案為A2B3C1。

從方差分析來看:F0.05(2，2)=19，三者均無統(tǒng)計學影響。

為了更充分地去除提取液中的雜質，決定醇沉時間為8 h，最后的醇沉方案為A2B3C2，即濃縮藥液至相對密度為1.15，加入乙醇使含乙醇量達到80%，醇沉8 h。

3.6 提取醇沉工藝驗證按處方比例稱取15倍量藥材3份，提取3次，每次加入8倍量的水，每次提取2 h，合并藥液，減壓濃縮至藥液比濃度為1.15，加入乙醇使含乙醇量達到80%，靜置8 h，而后至105℃恒溫干燥箱中干燥3 h。結果見表14。

表14 驗證實驗結果

由表14可知，按最佳提取醇沉方案實驗，出膏率可控制在11%左右，而黃芪甲苷的轉移率大于60%，說明以上方案是穩(wěn)定可行的。

4 討論

近年來，代謝綜合征已經成為世界醫(yī)學研究的熱點，西醫(yī)學對其治療有著明顯的效果，但也存在一定的不良反應。而中醫(yī)學具有整體辨證論治的優(yōu)勢，充分體現(xiàn)了科學的個體化治療思想，在治療上積極探索早期干預的時機，對減少或延緩相關心腦血管事件的發(fā)生無疑具有重要的臨床和社會意義［7-8］。

現(xiàn)代藥理學證明，黃連中的主要成分之一小檗堿亦能改善脂質代謝和胰島素的功效［9-10］。因此我們推測，益氣散聚方的基本作用之一可能是提高靶組織的胰島素敏感性，調節(jié)和改善機體代謝混亂的情況，從而改善肝臟的脂肪代謝［11-12］。然而用水提醇沉方法提取益氣散聚方時，對小檗堿的含有量和轉移率進行測定，結果均不夠理想。曾嘗試過調節(jié)水提液的pH值，希望在酸性條件下提高小檗堿的溶出度，降低其沉淀的風險，同時去除部分酸不溶性雜質，降低出膏率。但結果仍然不太理想，可能由于小檗堿在水溶液中溶解性較低，在提取液靜置過程中極易發(fā)生沉淀，造成大量損失。具體原因有待進一步考察。

本實驗中，藥材里含較多的淀粉等雜質，這些雜質在提取過程中也一起溶出，使浸膏得率偏高。經過預實驗得知，未經過醇沉的提取液其浸膏率達到14%以上，這些雜質可能成為將來制劑不穩(wěn)定的因素，同時過高的浸膏得率會使給藥劑量過大，不適合口腔給藥，故考慮用乙醇沉淀的方法去除水提液中的雜質。

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