食品和飼料中鐮刀菌毒素的檢測(cè)方法

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 張勇法

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院 楊建英 景愛華

鐮刀菌毒素是鐮刀菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，是影響谷物品質(zhì)的一個(gè)重要因素。受鐮刀菌毒素污染的食物進(jìn)入動(dòng)物體后，可抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的功能。目前污染小麥的鐮刀菌毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、伏馬毒素（fumonisin）、單端孢霉烯醇（又稱T-2毒素）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）。目前，我國(guó)對(duì)鐮刀菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，對(duì)伏馬毒素和T-2毒素尚無(wú)限量。因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和制定完善的鐮刀菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)提高小麥籽粒的品質(zhì)，保證食品安全具有重要意義。本文對(duì)鐮刀菌毒素檢測(cè)方法作一綜述。

1 生物學(xué)檢測(cè)法

Widestrand等（2003）利用鐮刀菌毒素具有細(xì)胞毒性的性質(zhì)，以5-溴-2'-脫氧尿苷（5-BrdU）生物鑒定來(lái)評(píng)估谷物提取液對(duì)3T3細(xì)胞DNA合成的影響，從而判斷谷物鐮刀菌毒素的含量。該方法較為簡(jiǎn)單，成本也低，適用于毒素檢測(cè)的初步篩選，但其所需時(shí)間較長(zhǎng)，專一性較差，不能確定一種或多種毒素的存在，也不能準(zhǔn)確定量，因此該方法使用范圍有限。

2 物理化學(xué)檢測(cè)法

2.1 薄層層析法 薄層層析法 （thin layer chromatography，TLC）是毒素檢測(cè)的經(jīng)典方法，本方法具快速、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度稍差，并且對(duì)研究人員和環(huán)境有危害，而且TLC法涉及到一個(gè)可視化顏色定量的問(wèn)題，還是不如氣相色譜和液相色譜方便、準(zhǔn)確（蔣木庚和楊紅，1997）。近年來(lái)應(yīng)用較少。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）法通過(guò)色譜法對(duì)毒素含量進(jìn)行測(cè)定，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏度高和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，己成為一種極為普及的真菌毒素的檢測(cè)手段。鮑蕾等（2005）采用免疫親和柱凈化、柱前衍生結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)谷物中的T-2毒素，結(jié)果表明，方法的檢測(cè)限為0.1 mg／kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于9%，回收率為80.0%～95.0%。 Lippolis等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，用I-NC、2-NC和PCC熒光標(biāo)記HPLC法測(cè)定樣品中的T-2毒素，其檢測(cè)限分別為10.0、6.3 ng和2.0 ng。Danyi等（2009）利用HPLC法測(cè)定食品添加劑中ZEN及其衍生物，在樣品前處理時(shí)比較了酶聯(lián)免疫色譜凈化與固相萃取凈化兩種方法對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前處理采用酶聯(lián)免疫色譜凈化法回收率為89%～110%，變異系數(shù)較?。欢捎霉滔噍腿艋ɑ厥章瘦^差，且待檢物較易受到萃取柱載體的影響。林維宣等（2001）采用免疫親和色譜法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑測(cè)定了醬油中伏馬毒素Bl、B2的含量，結(jié)果表明，回收率分別為84.6%～89.2%、60.3%～69.5%，最低檢出限分別為0.01、0.02 mg/kg。最近幾年，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及熒光HPLC等的廣泛應(yīng)用使得HPLC檢測(cè)的專一性顯著提高（Meister，2008；Berthiller等，2005）。

2.3 氣相色譜法 氣相色譜法（gas chromatography，GC）法多用于毒素及其代謝產(chǎn)物的微量測(cè)定，是分析測(cè)定單端孢霉烯族毒素化合物的最理想方法，具有靈敏度高、高分離效能、高檢測(cè)效能、分析快速等優(yōu)點(diǎn)。但是，該方法前處理較繁瑣，需要提純凈化。另外，氣相色譜儀價(jià)格昂貴，推廣應(yīng)用具有一定的局限性。梁穎等（2006）在分析鐮刀菌毒素的同時(shí)，還對(duì)其衍生化試劑及衍生條件進(jìn)行了比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟化衍生后檢測(cè)靈敏度較高，而硅烷化衍生不需加熱，在室溫下即可完成，且生成物穩(wěn)定。此外，ROMER公司推薦了乙腈-水（84:16，V/V）作為提取溶劑，該提取溶劑在目前鐮刀菌毒素分析中使用比較廣泛（Berthiller等 ，2005；Bily 等 ，2004；Eke等，2004）。目前，DON、T-2、ZEN和伏馬毒素的免疫親和柱均已商品化，被廣泛應(yīng)用于4種毒素的定量分析中（李軍等，2006；隋凱等 2006）。

2.4 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 質(zhì)譜與氣相色譜（gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS） 或液相色譜聯(lián)用 （liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS），能增強(qiáng)鑒定的可靠性，具有專一性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但由于只有專業(yè)測(cè)試或研究機(jī)構(gòu)中心才具備其設(shè)備，而且存在前處理較為繁瑣，需要對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化和濃縮等應(yīng)用瓶頸，所以并不適用于日常檢測(cè)，普及具有一定困難。羅毅等（1998）建立的鐮刀菌毒素的電子捕獲GC-MS法，檢測(cè)T-2毒素的最低限為5×10-11g。該法不僅能檢測(cè)低含量的化合物，而且能確定混合物中的某一化合物，廣泛應(yīng)用于T-2毒素以及其他真菌毒素的檢測(cè)，但是昂貴的設(shè)備限制了該法的廣泛使用。Mateo等 （2002）建立了對(duì)DON、NIV、ZEN、T-2和伏馬毒素 5種鐮刀菌毒素的LC-MS檢測(cè)法。劉承蘭等（2005）采用LC-MS/MS法測(cè)定了玉米和蘆筍中的伏馬毒素B1、B2的含量，樣品前處理采用固相萃取法凈化，最低檢測(cè)限為80 pg，回收率為78.3%～104.9%。

3 免疫學(xué)分析法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法 曹艷紅等（2006）采用直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)谷物中T-2毒素，結(jié)果表明，該方法最低檢出量為0.125 ng/mL，添加70～280 ng/g T-2毒素的大米樣品和面粉樣品的平均回收率分別為85%～117.5%和98.1%～102.5%。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法是測(cè)定小分子抗原的方法，尤其適用于食品安全中鐮刀菌毒素的檢測(cè)（陳愛華和楊堅(jiān)，2004）。Pal等（2004）建立免疫過(guò)濾膜法檢測(cè)T-2毒素的方法，該免疫過(guò)濾膜上分布著36種抗體點(diǎn)區(qū)域，試驗(yàn)利用T-2毒素-辣根過(guò)氧化物酶（T-2 toxin-HRP）作為示蹤分析物，以4-氯-1-萘酚作為底物，結(jié)果表明，該方法可以快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)出小麥和家禽飼料中的T-2毒素，檢測(cè)敏感度分別為 12.5 mg/kg和 25 mg/kg。

3.2 放射免疫法 Ler等（2006）研究報(bào)道，利用放射性標(biāo)記的三明治免疫學(xué)熒光化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法改進(jìn)ELISA法，檢測(cè)T-2毒素，可以提高檢測(cè)敏感度。宋康泰等（1987）合成了T-2毒素的人工抗原T2-BSA和3H標(biāo)記的T-2毒素，用T2-BSA免疫家兔獲得的高質(zhì)量的抗血清，與3H標(biāo)記T-2毒素的親和常數(shù)為3.2×109M-1，終滴度為l∶2000，測(cè)定水中T-2毒素的最低檢出限為1.0 ng/mL，測(cè)定血和尿的樣品時(shí)最低檢出限為2.0 ng/mL。然而，由于放射免疫有一定的危險(xiǎn)性，影響人身體健康，因此，該方法未被廣泛應(yīng)用。

3.3 免疫熒光法 熒光免疫分析（Fluoroimmunoassay）的方法很多，如熒光偏振免疫分析、熒光猝滅免疫分析、熒光增強(qiáng)免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析等。Lippolis等（2011）針對(duì)T-2毒素及其代謝物HT-2毒素建立了免疫熒光檢測(cè)方法。免疫熒光法檢測(cè)鐮刀菌毒素，能夠達(dá)到ng甚至pg的檢測(cè)水平。

4 T-2毒素的其他檢測(cè)法

由于以上方法只能檢測(cè)一種T-2毒素，而T-2毒素的代謝物HT-2也常常存在于污染的谷物中，為了滿足實(shí)際檢測(cè)的需要，Visconti等（2005）建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)T-2和HT-2毒素的靈敏精確的新方法，即熒光標(biāo)記的高效液相色譜法，免疫親和凈化后，1-antroylnitrile（1-AN）作為標(biāo)記試劑，T-2毒素和其代謝物HT-2檢出率分別為5 μg/kg和 3 μg/kg。 此外，Li等（2009）用桔林油脂酵母α-淀粉酶基因插入可以表達(dá)人體細(xì)胞色素P4503A4和同源的人CYP 450還原酶的啤酒酵母中。將該菌株和葡聚糖表達(dá)菌株用于微孔板真菌毒素生物學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)，用甲醇作溶劑，多粘菌素B九肽作為滲透促進(jìn)劑；通過(guò)熒光檢測(cè)糖酶的分泌受到抑制程度顯示其毒性，可以檢測(cè)T-2毒素的最低劑量為100 ng/mL。

[1]鮑蕾，張藝兵，劉心同，等.高效液相色譜法檢測(cè)出入境糧谷中的T-2毒素[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2005，15（2）：49 ～ 51.

[2]曹艷紅，孟憲清，馮杰，等.檢測(cè)T-2毒素的直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志，2006，22（2）：132 ～ 135.

[3]陳愛華，楊堅(jiān).酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑，2004，4：109 ～ 112.

[4]蔣木庚，楊紅.有機(jī)分析[M].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997.87～116.

[5]李軍，許燁，隋凱，等.免疫親和柱凈化/柱前衍生化-高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定糧谷中的 T-2 毒素[J].色譜，2006，3（24）：256 ～ 259.

[6]梁穎，張春暉，劉鄰渭.氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定DON和NIV及其衍生方法的比較研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（2）：2 ～ 5.

[7]林維宣，田苗，隋凱.單克隆免疫親和柱-高效液相色譜法測(cè)定醬油中伏馬毒素 Bl、B2[J].中國(guó)調(diào)味品，2001，1：28 ～ 30.

[8]劉承蘭，許文娜，Andreas K，等.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的伏馬毒素[J].分析化學(xué)，2005，33（11）：16 ～ 19.

[9]羅毅，鄭集聲，楊進(jìn)生.八種鐮刀菌毒素的電子捕獲氣相色譜分析[J].環(huán)境化學(xué)，1989，8（6）：27 ～ 31.

[10]宋康泰，張利軍，龔雄麒，等.T-2毒素的放射免疫測(cè)定[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1987，2：195 ～ 198.

[11]隋凱，李軍，衛(wèi)鋒，等.免疫親和柱-高效液相色譜法檢測(cè)玉米中的玉米赤霉烯酮[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，6（16）：657 ～ 658.

[12]Berthiller F，Schuhmacher R，Buttinger G，et al.Rapid simultaneous determination of major type A-and B-trichothecenes as well as zearalenone in maize by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2005，1062（2）：209 ～ 216.

[13]Bily A C，Reid L M，Savard M E，et al.Analysis of Fusarium graminearum mycotoxins in different biological matrices by LC/MS[J].Mycopathologia，2004，157（1）：117 ～ 126.

[14]Danyi S，Brose F，Brasseur C，et al.Analysis of EU priority polycyclic aromatic hydrocarbons in food supplements using high performance liquid chromatography coupled to an ultraviolet，diode array or fluorescence detector[J].Anal Chim Acta，2009，633（2）：293 ～ 299.

[15]Eke Z，Kende A，Torkos K.Simultaneous detection of A and B trichothecenes by gas chromatography with flame ionization ormass selective detection[J].Microchemical Journal，2004，78：211 ～ 216.

[16]Ler S G，Lee F K，Gopalakrishnakone P.Trends in detection of warfare agents.Detection methods for ricin，staphylococcal enterotoxin B and T-2 toxin[J].J Chromatogr A，2006，1133（1 ～ 2）：1 ～ 12.

[17]Li X，Millson S，Coker R，et al.A sensitive bioassay for the mycotoxin aflatoxin B（1），which also responds to the mycotoxins aflatoxin G（1） and T-2 toxin，using engineered baker’s yeast[J].J Microbiol Methods，2009，77（3）：285～291.

[18]Lippolis V，Pascale M，Maragos C M，et al.Improvement of detection sensitivity of T-2 and HT-2 toxins using different fluorescent labeling reagents by high-performance liquid chromatography[J].Talanta，2008，74（5）：1476～1483.

[19]Lippolis V，Pascale M，Valenzano S，et al.A rapid fluorescence polarization immunoassay for the determination of T-2 and HT-2 toxins in wheat[J].Anal Bioanal Chem，2011，401（8）：2561 ～ 71.

[20]Mateo J J，Mateo R，Hinojo M J，et al.Liquid chromatographic determination of toxigenic secondary metabolites produced by Fusarium strains[J].J ChromatogrA，2002，955（2）：245 ～ 256.

[21]Meister U.Analysis of T-2 and HT-2 toxins in oats and other cereals by means of HPLC with fluorescence detection[J].Mycotoxin Research，2008，24：31～39.

[22]Pal A，Acharya D，Saha D，et al.Development of a membrane-based immunofiltration assay for the detection of T-2 toxin[J].Anal Chem，2004，76（14）：4237 ～ 4240.

[23]Visconti A，Lattanzio V M，Pascale M，et al.Analysis of T-2 and HT-2 toxins in cereal grains by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography with fluorescence detection[J].J Chromatogr A，2005，1075（1 ～ 2）：151 ～ 158.