快速老化小鼠SAMP8在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用①

李延崢，李林，張?zhí)m

目前，全世界大概有3560萬癡呆患者，而到2050年，癡呆人數(shù)會超過1.15億。常見的癡呆類型包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)、路易體癡呆(dementia with Lewy bodies)和前額葉癡呆。其中阿爾茨海默病是最常見的老年癡呆，是以認(rèn)知功能障礙、記憶能力下降、皮層和海馬神經(jīng)元丟失為特點的神經(jīng)變性病。阿爾茨海默病的病理特征是腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑伴有β-淀粉樣蛋白(amyloid beta-peptides,Aβ)沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，膽堿能神經(jīng)元功能障礙，突觸和樹突棘減少[1]。散發(fā)型阿爾茨海默病構(gòu)成阿爾茨海默病患者的絕大部分，散發(fā)型阿爾茨海默病患者常在60~70歲時發(fā)病，并隨增齡出現(xiàn)發(fā)病率的升高。此外，另有少數(shù)為遺傳相關(guān)的家族型阿爾茨海默病。這些阿爾茨海默病患者早期發(fā)病，并與一些遺傳基因的突變相關(guān)，包括前體蛋白(APP)、tau和PS-1基因[2]?；谶@些家族性基因突變培育出的眾多的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是目前常用于阿爾茨海默病研究的動物模型。但這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型只在短期內(nèi)表現(xiàn)出阿爾茨海默病的一些病理特征，并不能完全模擬阿爾茨海默病的自然發(fā)病過程，有其自身局限性。

SAMP8小鼠是由日本京都大學(xué)Takeda教授領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在1970年培育的[3]，前身是AKR/J系小鼠，以早期出現(xiàn)快速老化并伴有顯著的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙為特征，且隨增齡而加重。眾多的研究也表明，SAMP8小鼠存在膽堿能功能缺失、氧化應(yīng)激損傷、膜脂質(zhì)改變和生理節(jié)律紊亂。同時，SAMP8小鼠腦內(nèi)過量產(chǎn)生APP、Aβ，并伴有磷酸化tau蛋白表達(dá)量的增加，這些均與阿爾茨海默病患者腦內(nèi)的病理改變相一致。此外，SAMP8小鼠作為研究阿爾茨海默病的動物模型，具有其自身的獨特優(yōu)勢[4]：①95%以上的阿爾茨海默病均為散發(fā)，SAMP8小鼠在研究晚發(fā)型阿爾茨海默病和年齡相關(guān)性阿爾茨海默病的散發(fā)病例方面具有顯著的優(yōu)勢；②前期研究表明，SAMP8小鼠腦內(nèi)有年齡相關(guān)性APP的表達(dá)增加和Aβ樣斑的形成；8月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)即出現(xiàn)可溶性Aβ的沉積，這與阿爾茨海默病患者早期輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)階段的病理表現(xiàn)相似；而18月齡的SAMP8小鼠腦內(nèi)可觀察到Aβ淀粉樣斑，表現(xiàn)為晚發(fā)型和年齡相關(guān)性Aβ淀粉樣斑的形成，而這又與阿爾茨海默病患者晚期的病理表現(xiàn)相一致；③SAMP8小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)tau蛋白的異常磷酸化，可作為評價療效的指標(biāo)?；赟AMP8小鼠在阿爾茨海默病研究領(lǐng)域的重要地位，現(xiàn)就其近期的研究進展進行綜述。

1 學(xué)習(xí)記憶功能障礙

最初的研究表明，與SAMR1小鼠相比，2月齡SAMP8小鼠即出現(xiàn)被動回避和單向刺激回避能力減低[5]。Morris水迷宮實驗是一種讓實驗動物學(xué)習(xí)尋找水中隱蔽平臺的操作過程，已成為一種研究動物空間學(xué)習(xí)和記憶的標(biāo)準(zhǔn)模式，能較準(zhǔn)確地反映出動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。在Morris水迷宮中，SAMP8小鼠找到平臺所需時間明顯延長[6]。而在用于空間行為能力測試的八臂水迷宮中，SAMP8小鼠也表現(xiàn)出輕度的學(xué)習(xí)記憶功能缺陷[7]?？梢?，SAMP8小鼠是用來研究增齡性學(xué)習(xí)記憶障礙的一個有效的動物模型。

2 Aβ異常沉積

一般認(rèn)為阿爾茨海默病的病因主要與Aβ的過量產(chǎn)生相關(guān)。淀粉狀蛋白假說表明，Aβ能夠通過激活GSK3β，促使tau蛋白磷酸化，進而形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。此外，可溶性淀粉狀蛋白還能夠引起突觸功能障礙及隨之產(chǎn)生的認(rèn)知功能缺陷[1]。Morley的研究團隊通過應(yīng)用不同的小鼠抗體，發(fā)現(xiàn)老年SAMP8小鼠腦內(nèi)APP和Aβ蛋白水平顯著增加[8]。Del Valle發(fā)現(xiàn)，6月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)即有Aβ蛋白的異常沉積，這些沉積物中包含有Aβ1-40和Aβ1-42，以及其他Aβ的前體小片段，而作為對照組的SAMR1和ICR-CD1小鼠直到15月齡時才出現(xiàn)少量Aβ沉積，表明SAMP8小鼠在作為有關(guān)Aβ沉積方面的阿爾茨海默病發(fā)病機制的研究中具有很重要的價值[9]。此外，Manich等的近期研究表明，SAMP8小鼠腦內(nèi)Aβ陽性顆粒與硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)陽性顆粒共表達(dá)，Aβ陽性顆粒處還可見到tau和MAP-2蛋白的表達(dá)[10]?，F(xiàn)在的觀點認(rèn)為，Aβ在早發(fā)型阿爾茨海默病患者的發(fā)病中起到關(guān)鍵性作用。近來提出的以Aβ為靶點的被動免疫療法被視為是阿爾茨海默病免疫治療的一種新方法。研究通過應(yīng)用Aβ1-42的單克隆抗體A8被動免疫SAMP8小鼠，能夠提高SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，減少腦內(nèi)Aβ和tau蛋白磷酸化水平[11]。

3 tau蛋白高度磷酸化

tau蛋白是一種低分子量的微管相關(guān)蛋白，在穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)微管聚集方面起到關(guān)鍵性作用。tau蛋白的異常磷酸化，能夠顯著地降低微管穩(wěn)定性，促使微管解聚。tau蛋白聚集成雙螺旋的結(jié)構(gòu)，參與阿爾茨海默病患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維的形成。Cdk5和GSK3β被認(rèn)為是導(dǎo)致tau蛋白異常高度磷酸化的關(guān)鍵激酶[12]。曾有研究表明，5月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)即出現(xiàn)tau蛋白(Ser404，Thr205位點)高度磷酸化，且與Cdk5/p25通路的活性增加相關(guān)，而與Akt/GSK3β通路的活性無關(guān)[13]。近期一項有關(guān)昔多芬(sildenafil)的藥物研究中發(fā)現(xiàn)，9月齡的SAMP8小鼠的Akt/GSK3β通路活性增加，同時伴有tau蛋白(Ser396，Ser404位點)磷酸化水平增加[14]。

4 神經(jīng)遞質(zhì)改變

早期認(rèn)為，膽堿能神經(jīng)功能缺失是阿爾茨海默病發(fā)病的重要原因之一。這使得眾多的藥物研發(fā)以改善阿爾茨海默病患者腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元功能為靶點。SAMP8小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶乙?；D(zhuǎn)移酶活性降低，而乙酰膽堿酯酶的活性并無明顯改變，但是丁基膽堿酯酶(BuChE)的活性上升。阿爾茨海默病患者腦脊液內(nèi)BuChE水平也是升高的[15]。10月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸釋放增加，谷氨酸和谷氨酰胺水平升高[16]。6月齡SAMP8小鼠腦內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)活性降低，乙酰膽堿釋放減少[17]。NMDA受體激活能夠使細(xì)胞鈣離子內(nèi)流增加，蛋白激酶C和鈣調(diào)蛋白激酶激活，促使環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化水平增加，參與與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的長時程增強效應(yīng)(LTP)的形成。有研究表明，老年SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)NMDA受體結(jié)合能力降低，蛋白激酶C水平下降，CREB磷酸化水平降低，共同促使其學(xué)習(xí)記憶功能障礙[18-19]。

5 突觸結(jié)構(gòu)和功能障礙

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸承擔(dān)著神經(jīng)元間信息傳遞的重任，阿爾茨海默病患者記憶能力的降低與腦內(nèi)突觸的超微結(jié)構(gòu)改變相關(guān)[20]。在突觸部位的諸多結(jié)構(gòu)因素中，突觸后致密物質(zhì)是一種非常敏感的易變參數(shù)，極易受突觸前傳入信息的狀況及身體內(nèi)外環(huán)境等眾多因素的影響而發(fā)生變化。突觸后致密物(postsynaptic dense,PSD)的形態(tài)變化也反映突觸后膜上受體與離子通道的變化，在功能上影響突觸傳遞的效率。老年SAMP8小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白PSD-95、MAP2和突觸素表達(dá)水平降低，通過藥物增加表達(dá)水平，能夠顯著改善學(xué)習(xí)記憶功能[21-22]。此外，SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)樹突棘的密度有顯著的下降，這也與阿爾茨海默病患者腦內(nèi)的病理改變相一致[23-24]。

6 生理節(jié)律紊亂

SAMP8小鼠隨增齡出現(xiàn)加速的生理節(jié)律改變。SAMP8小鼠活動性的增加往往出現(xiàn)在睡眠狀態(tài)下，這與阿爾茨海默病的生理節(jié)律紊亂、夜間活動性增加相一致[25]。褪黑素能夠同時改善SAMP8小鼠和阿爾茨海默病患者的生理節(jié)律紊亂[26]。SAMP8小鼠隨增齡出現(xiàn)慢波睡眠增加伴潛伏期縮短，并伴有覺醒時限減少[27]。老年SAMP8小鼠反常睡眠更為常見，其睡眠時θ峰頻率明顯減慢，這種θ節(jié)律的降低能夠通過損傷長時程增強效應(yīng)進而造成與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬功能的損害。而在阿爾茨海默病患者疾病早期即可觀察到睡眠時θ節(jié)律的改變[28]。SAMP8小鼠海馬內(nèi)視磺酸受體α和甲狀腺激素結(jié)合蛋白水平降低，視黃酸受體激動劑能夠增加SAMP8小鼠大腦皮層內(nèi)乙酰膽堿的水平，進而緩解SAMP8小鼠所出現(xiàn)的快動眼睡眠時限的減少[29]。由此可見，SAMP8小鼠生理節(jié)律紊亂與其記憶受損之間可能存在著一定的聯(lián)系。

7 基因表達(dá)改變

早老素-1是γ-分泌酶復(fù)合物的一個重要組成部分，其他組件包括nicastrin、APH-1和Pen-2。γ-分泌酶能夠裂解淀粉樣前體蛋白，通過γ-分泌酶的作用產(chǎn)生Aβ1-40和Aβ1-42小肽片段。通過對SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)早老素-1的研究發(fā)現(xiàn)，與CD-1鼠相比，SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)早老素-1的表達(dá)水平升高[30]。2000年，Kumar等發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)的伴侶蛋白調(diào)節(jié)家族和一些代謝酶的基因表達(dá)發(fā)生改變[31]。其中，異代謝酶在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用，而伴侶蛋白信號復(fù)合物參與tau蛋白和淀粉樣蛋白等異常蛋白沉積的病理過程[32]。Carter發(fā)現(xiàn)，趨化因子CCL19在老年SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)出現(xiàn)異常高的表達(dá)，這表明炎癥在SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能損傷方面起促進作用[33]。

8 睪酮水平降低

老年男性隨增齡出現(xiàn)睪酮水平的下降，在阿爾茨海默病的男性患者中，其睪酮水平更低。有研究發(fā)現(xiàn)，具有生物活性睪酮水平的降低，能夠成為獨立預(yù)測患者從輕度認(rèn)知功能障礙向阿爾茨海默病發(fā)展的疾病進展階段的一個有效指標(biāo)[34]。12月齡SAMP8小鼠睪酮水平顯著降低[35]。而通過睪酮替代療法能夠提高SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，減輕海馬內(nèi)皮細(xì)胞的老化。睪酮能夠通過NAD+依賴的脫乙?；窼IRT1保護血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，增加eNOS的水平，進而誘導(dǎo)SIRT1的表達(dá)。而SIRT1又通過上調(diào)eNOS的水平來抑制血管內(nèi)皮的老化[36]。

9 血腦屏障破壞

近期有研究表明，12月齡SAMP8小鼠血腦屏障(BBB)破壞明顯，血管壁有大量的淀粉樣物質(zhì)沉積，推測這些淀粉樣沉積物可能導(dǎo)致BBB的破壞[37]。進入大腦的淀粉樣前體蛋白的運輸是依賴于先進糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)和溢出轉(zhuǎn)運受體(低密度脂蛋白受體，LDLR)的水平。與SAMR1相比，SAMP8小鼠腦內(nèi)RAGE和LDLR的表達(dá)水平均升高[38]。Aβ溢出被認(rèn)為是阿爾茨海默病患者腦內(nèi)Aβ增加的一個重要機制，而老年SAMP8小鼠腦內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42溢出明顯增加[39]。這些研究表明，SAMP8小鼠腦內(nèi)BBB的破壞可能與Aβ的運輸改變相關(guān)，并造成腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高，進而促使其出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

綜上所述，SAMP8小鼠是與阿爾茨海默病病理過程極為相似的動物模型，它在早期即出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，Aβ異常沉積，tau蛋白磷酸化，神經(jīng)遞質(zhì)改變，突觸結(jié)構(gòu)和功能障礙，生理節(jié)律紊亂，以及基因表達(dá)等多方面的特征性改變，而這些改變的出現(xiàn)與人類阿爾茨海默病相一致。因此，SAMP8小鼠是用來研究阿爾茨海默病及其相關(guān)藥物研發(fā)的一個很有價值的動物模型。

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