苜蓿黃酮的研究進(jìn)展及其在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 陳佩佩 占今舜 閆景彩＊

黃酮類化合物是苜蓿中主要的生物活性成分之一，具有抗氧化清除自由基的作用，可以作為天然抗氧化劑。苜蓿黃酮還具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能，以及微量雌激素樣作用。本文就苜蓿黃酮的分類、含量影響因素、提取方法和生物學(xué)功能及其在禽生產(chǎn)中的應(yīng)用作一綜述。

1 苜蓿黃酮的分類

苜蓿黃酮是苜蓿生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于苜蓿的莖葉中。苜蓿屬中的黃酮類成分約有80余種，來源于紫花苜蓿的有30余種，據(jù)報道苜蓿屬植物的黃酮類成分主要有以下幾種結(jié)構(gòu)類型：黃酮及其苷類、黃酮醇及其苷類、異黃酮類、異黃烷、查耳酮、二氫黃酮、二氫異黃酮和紫檀烷類等（何春年等，2006）。苜蓿屬中黃酮類成分的母核主要為芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黃素、美迪紫檀素山奈酚、槲皮素、楊梅黃素、蘆丁、燃料木黃酮、刺芒柄花黃素和大豆素等。其中芹菜素、木犀草素、苜蓿素、金圣草黃素、刺芒柄花黃素、槲皮素、燃料木黃酮和美的紫檀素等母核的結(jié)構(gòu)均存在于紫花苜蓿中，并以芹菜素、木犀草素、苜蓿素最為常見。

2 影響苜蓿黃酮含量的因素

2.1 品種間的差異 由于自身的遺傳特性及對環(huán)境的適應(yīng)性的不同，不同苜蓿品種間在總黃酮含量上也表現(xiàn)出比較顯著的差異。薄亞光等（2008）對6個紫花苜蓿品種莖、葉中總黃酮進(jìn)行提取和測定，結(jié)果表明，各品種、株系總黃酮含量有差異，其中品種牧歌三葉型總黃酮含量最高，為7.08 mg/g，品種全能三葉型含量最低，為6.32 mg/g。徐文燕（2007）考察不同品種和采收季節(jié)紫花苜蓿中黃酮含量，結(jié)果表明，品種和采收季節(jié)對紫花苜蓿中的總黃酮含量均有明顯影響，并且不同品種中的總黃酮含量對季節(jié)變化的敏感性不同。

2.2 環(huán)境因素對苜蓿黃酮含量的影響 植物的次生代謝產(chǎn)物是其在長期的自然存在中選擇、變異和適應(yīng)的結(jié)果，因此次生代謝產(chǎn)物的合成會受到環(huán)境因素的調(diào)控。目前研究表明，影響苜蓿黃酮合成的環(huán)境因子主要包括光照、溫度、CO2濃度、礦物質(zhì)營養(yǎng)和土壤水分等幾個因素。

光照和溫度是兩大影響因素，可以直接影響到黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，對植株中黃酮含量有明顯的調(diào)節(jié)作用。高光照、較低的平均溫度可以使黃酮類成分合成途徑中相關(guān)酶的活性大幅度提高，從而有利于黃酮類物質(zhì)的積累，故夏季植株中黃酮含量高于春季，在夏季收割提取為宜。CO2濃度是間接影響因素，主要通過影響黃酮類物質(zhì)前體的數(shù)量來影響其合成。礦物質(zhì)元素是作物生長所必需的，適量限制氮、磷肥的施用有利于黃酮類成分的積累。Strisse等（2005）研究報道，高氮降低蘋果葉片中總黃酮含量的機(jī)制在于使L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性下調(diào)，從而影響下游黃酮的合成。Stewart等（2001）對不同施肥狀態(tài)下的番茄進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，限制氮肥后，黃酮醇含量在番茄葉片中顯著增加；限制磷肥后黃酮醇含量在果實發(fā)育初期顯著增加。

3 苜蓿黃酮的提取、測定及分離方法

3.1 提取方法 目前苜蓿黃酮的提取方法，主要有索式提取法、有機(jī)溶劑浸提法、熱水浸提法、堿提酸沉法等幾種方法。

有機(jī)溶劑提取法是提取苜蓿黃酮的理想方法，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，高體積分?jǐn)?shù)的醇（90%～95%）適于提取苷元，體積分?jǐn)?shù)60%左右的醇適合提取苷類（張研等，2008）。邢軍等（2008）利用乙醇提取苜蓿黃酮，通過單因素和正交試驗，確定乙醇提取苜?？傸S酮的最佳條件為：浸提劑選用70%乙醇，料液比為1∶50，浸提溫度為80℃，浸提時間為4 h，浸提次數(shù)為2次。

但傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法耗時相對較長，近年來，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法廣泛應(yīng)用于植物天然有效成分的提取，是很有發(fā)展前景的方法。鄧斌等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇浸提的基礎(chǔ)上，采用超聲波輔助技術(shù)提取苜蓿黃酮，萃取時間短、溶劑用量少、提取效率高、重現(xiàn)性好。馮濤等（2008）對苜蓿黃酮采用了加熱回流、索氏提取、超聲提取3種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取法提取黃酮可顯著提高黃酮得率，最佳提取工藝為：60%乙醇，30∶1 的液固比，提取 3 次，1 h/次。 張詠梅等（2008）采用微波輔助提取法提取苜蓿黃酮，結(jié)果表明，最佳提取工藝為：體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇，固液比為1∶30，微波500 W功率下作用60 s。3.2 測定方法 黃酮含量的測定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法、紙色譜PC和薄層色譜TLC法、熒光測定法、原子吸收光譜法、近紅外漫反射光譜法、共振散射光譜法、薄層掃描法和單掃示波極譜法等，其中最常用的就是紫外分光光度法和高效液相色譜法 （董彩軍和李鋒，2010）。

紫外分光光度法是以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，在其紫外最大吸收峰510 nm處測定試樣的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較并定量計算苜蓿黃酮含量。叢媛媛等（2006）采用紫外分光光度法測定了苜蓿黃酮的含量，結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性好，操作簡單，平均加樣回收率為96.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.32%。紫外分光光度法可以定量的計算苜蓿中總黃酮的含量，但是此方法前處理復(fù)雜，需要對樣品進(jìn)行純化。

高效液相色譜法具有分離效果好、準(zhǔn)確性高、分析速度快，以及儀器自動化程度高等特點(diǎn)，尤其適合對揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大，以及離子型化合物的分析，已廣泛用于植物天然活性成分的分析。徐文燕等（2007）利用高效液相色譜法同時測定出苜蓿中幾種主要黃酮成分：芹菜素、苜蓿素和7，4’一二羥基黃酮。李存滿等（2006）采用高效液相色譜法測定苜蓿中苜蓿素的含量，較好的色譜條件為：色譜柱為Agilent Zorbox C18，流動相為甲醇-水（65∶35），流速為 0.8 mL/min，檢測波長為349 nm，進(jìn)樣量為5 μL，溫度為室溫。

3.3 分離方法 關(guān)于黃酮類化合物的分離純化方法有很多，主要有薄層層析法、柱層析法、紙層析法、超臨界CO2萃取法和大孔樹脂吸附法等（宋秋華等，2007）。

大孔樹脂是近年來發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，是依靠其和被吸附的分子（吸附質(zhì)）之間的范德華引力，通過其巨大的比表面進(jìn)行物理吸附而工作的。其具有物化穩(wěn)定性高、吸附選擇性好、不受無機(jī)物存在的影響、再生簡單、解析條件溫和、使用周期長、易于構(gòu)成閉路循環(huán)及節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于物質(zhì)的分離純化。朱宇旌等（2008）采用大孔吸附樹脂HPH480對苜蓿異黃酮進(jìn)行純化，動態(tài)吸附試驗結(jié)果表明，較好的動態(tài)吸附條件為：上樣液濃度0.6～1.2 mg/mL，上樣液pH 為 5，徑高比為 1∶20，預(yù)吸附 4 h，流速 2 mL/min，上樣液溫度40℃，采用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇60℃洗脫，流速為1.0 mL/min，洗脫劑用量為4 BV（床容積），在此條件下得到的苜蓿異黃酮純度可在10%以上，較粗提物提高3倍以上。

4 苜蓿黃酮的生物學(xué)功能

4.1 抗氧化 朱宇旌等（2006）在豬油中加入不同比例紫花苜蓿黃酮粗提物，結(jié)果表明，添加苜蓿黃酮粗提物對豬油具有良好的抗氧化作用，但不如維生素C效果好；另外，維生素C和維生素E對苜蓿黃酮粗提物具有明顯的協(xié)同抗氧化作用，效果優(yōu)于單獨(dú)添加黃酮粗提物和維生素C。李寶蘭等（2009）研究報道，灌胃苜?？傸S酮的小鼠全血中的甘油三脂和低密度脂蛋白的含量明顯降低（P＜0.05），而高密度脂蛋白膽固醇含量升高；小鼠的肝臟和腎臟組織勻漿中過氧化物歧化酶的活性顯著升高（P＜0.05），丙二醛含量降低。這說明苜?？傸S酮具有降血脂、降低低密度脂蛋白膽固醇、預(yù)防和減緩動脈硬化的作用，同時還具有抑制氧自由基損傷防止脂質(zhì)過氧化的作用。黃酮類化合物抗氧化及消除自由基的機(jī)理主要包括兩個方面：一是絡(luò)合那些具有氧化作用的金屬離子，形成螯合物，從而降低金屬的氧化作用；二是能和自由基進(jìn)行反應(yīng)，從而消除某些自由基的氧化作用（鄭裕國等，2003）。

4.2 提高免疫力 吳健全等（2005）研究報道，苜蓿中的染料木黃酮可以提高輻射小鼠的免疫功能，在Csy射線照射試驗中，供給0.08%染料木黃酮的小鼠與正常小鼠比較，淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)提高86.8%，血清溶血素含量提高90.9%，同時脾臟功能也有很大提高。這可能與染料木黃酮強(qiáng)烈抑制促癌劑TPA誘導(dǎo)的多形核細(xì)胞及HL-60細(xì)胞中H2O2的形成，并中等強(qiáng)度地抑制HL-60細(xì)胞中超氧陰離子自由基的產(chǎn)生有關(guān)。

4.3 抗腫瘤 Boue等 （2003）在乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖化驗中發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿甲醇提取物表現(xiàn)出了超過雌二醇的雌激素活性，可以誘導(dǎo)具有抑制細(xì)胞增殖作用的基因的表達(dá)。余小平等（2005）用 5 μmol／L的染料木黃酮處理乳腺癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸下降，表明染料木黃酮能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上降低乳腺癌的發(fā)病率。Wang等（1999）體外試驗研究表明，芹菜素對白血病細(xì)胞株HL-60具有抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用。Fotsis等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌的促進(jìn)血管生長的bFGF（堿性成纖維生長因子）活性降低其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用。Cai等（2005、2004）研究報道，在突變型 Apcmin鼠4～18周齡期間的飼糧中添加0.2%的苜蓿素，與對照組相比，患腸癌的機(jī)率降低了33%，進(jìn)一步的試驗還發(fā)現(xiàn)苜蓿素可以抑制惡性胸腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的生長。

4.4 類雌激素作用 研究證實苜蓿的雌激素作用活性，主要與其所含的異黃酮化合物有關(guān)。異黃酮化合物可以結(jié)合到雌二醇激素受體上，發(fā)揮雌激素樣作用，可以作為輔助治療用于低雌激素狀況，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。苜蓿含有3種主要的植物雌激素：香豆雌酚、燃料木黃酮和forrnonetin，兩種次要的為大豆黃酮和biochaninA。香豆雌酚活性相當(dāng)于雌二醇的5%，燃料木黃酮和forrnonetin分別為 1%和 0.01%（Noteboom，1963）。大豆黃酮、染料木黃酮等異黃酮可緩解去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松和脂肪代謝失調(diào)（Uesugi等，2001）。

5 在雞生產(chǎn)中應(yīng)用

熊小文等（2012）研究飼糧中添加苜蓿黃酮提取物對崇仁麻雞母雛生長性能和養(yǎng)分利用率的影響，結(jié)果表明，苜蓿黃酮提取物在一定程度上提高了崇仁麻雞母雛平均日采食量、雞只的體重和日增重，并在第15～21 d達(dá)到顯著水平；降低了料重比，提高養(yǎng)分利用率；降低粗脂肪的利用率，提高鈣的利用率。說明日糧中添加適量的苜蓿黃酮提取物，能夠促進(jìn)雞的生長，降低脂肪的沉積，改善胴體品質(zhì)，提高生產(chǎn)效益。周萍芳（2011）研究結(jié)果表明，在雞的日糧中添加含有黃酮300 mg/kg的苜蓿黃酮提取物，能夠降低麻雞血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、尿素氮和尿酸含量，提高高密度脂蛋白膽固醇含量；降低腹脂率、皮下脂肪厚度、肌間脂肪寬度和胸肌和腿肌中脂肪含量，提高胸肌和腿肌中蛋白質(zhì)含量；提高脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)。說明日糧中添加適量的黃酮提取物可以提高麻雞的生產(chǎn)性能，提高營養(yǎng)物質(zhì)的代謝率，降低血脂，提高胴體品質(zhì)，降低腹脂率，改善免疫功能。另外，有研究表明，在肉仔雞的日糧中添加600 mg/kg的苜蓿素可以提高肉仔雞的生長性能，提高飼料轉(zhuǎn)化率（佟建明等，2004）。

6 小結(jié)

苜蓿屬植物資源豐富，分布范圍廣。但目前對苜蓿資源的利用主要以干草或草粉的形式作為畜禽飼料，少部分經(jīng)加工后作為飼料添加劑應(yīng)用，對苜蓿中的活性物質(zhì)如黃酮的研究、開發(fā)和利用較少，僅局限于實驗室，不能用于大規(guī)模生產(chǎn)。隨著研究的不斷深入，生產(chǎn)技術(shù)的不斷成熟，相信苜蓿黃酮將會作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)中。

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