LC－MS/MS在硝基呋喃類獸藥殘留檢測中的應(yīng)用概述

徐建飛 ，王 偉，杜曉寧

(上海化工研究院上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

隨著人民物質(zhì)生活水平的提高，對食品安全的關(guān)注也越來越多。然而，目前食品安全卻不容樂觀，特別是動物源性食品安全問題，已成為一個全球性的議題，獸藥殘留是導(dǎo)致食品安全性下降的一個主要原因。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)獸藥殘留聯(lián)合立法委員會的定義［1］，獸藥殘留是指動物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。隨著獸藥和藥物添加劑在畜禽飼養(yǎng)過程中的長期不合理使用，殘留在動物體內(nèi)的獸藥，隨著食物鏈進入人體，對人類的健康構(gòu)成潛在威脅。因此，加強對獸藥殘留的檢測，對保護生態(tài)環(huán)境和人類的身體健康有著極其重要的現(xiàn)實意義。硝基呋喃類藥物是一類化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，廣泛使用于敏感菌所致的泌尿系統(tǒng)感染治療，是可能被非法使用的一類違禁獸藥。近年來，質(zhì)譜技術(shù)以其分析更趨簡單、準確和快速的優(yōu)點，在獸藥殘留的檢測方面已得到廣泛的應(yīng)用。

1 硝基呋喃類獸藥殘留檢測方法

目前，廣泛使用的硝基呋喃類獸藥殘留檢測方法主要有微生物學(xué)檢測法、免疫分析法、儀器分析法、以及生物傳感器、納米材料、生物芯片等新技術(shù)［2］。

微生物學(xué)檢測法是測定抗生素殘留的經(jīng)典方法，具有前處理簡單、經(jīng)濟以及批量大等優(yōu)點，但精確度、準確度和特異性不高，缺乏靈敏度;免疫分析法雖然具有較高的檢測靈敏度，但此方法樣品前處理較復(fù)雜，假陽性率高，很難實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，不能滿足快速、無損傷的檢測要求;生物傳感器和納米材料等新的檢測技術(shù)還不夠成熟，定量檢測結(jié)果也不穩(wěn)定。

儀器分析法主要指色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(如GC－MS、LC－MS、GC－IR/MS)。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其靈敏快速、分辨率高、重現(xiàn)性好以及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點而被歐盟、中國及其他國家列為指定的獸藥殘留分析手段。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時利用了液相色譜較強的分離能力與質(zhì)譜檢測器豐富的結(jié)構(gòu)信息，為目標化合物提供了可靠的定性和定量結(jié)果。由于目前主流的篩選方法的局限性，其檢測陽性結(jié)果都必須通過明確的驗證方法來進行定性和定量分析［3］，而質(zhì)譜能夠同時提供定性和定量信息，因此發(fā)達國家對于動物源性食品中的獸藥殘留檢測均要求采用質(zhì)譜法進行檢測。

2 硝基呋喃類獸藥殘留檢測現(xiàn)狀

硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝速度快、半衰期短，難以檢出原藥殘留。出于安全性考慮，世界上絕大多數(shù)國家包括中國、歐盟、美國等規(guī)定在動物食用組織中不允許有硝基呋喃類藥物的殘留。如歐盟已于1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，并將其列為A類禁用藥物(EEC/1442/95 和 EEC/2901/93)［4－5］，歐盟公報(2003/181/EC)［6］中規(guī)定所有家禽肉類和魚類中的四種硝基呋喃類藥物的最低殘留量為1.0 μg/kg。我國也于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類獸藥的禁令。

由于呋喃類藥物能快速代謝而不易在食用動物組織中被檢測到，通過測定母體化合物的方法檢測硝基呋喃殘留是不合適的［7］，但硝基呋喃在動物用藥后所形成的蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物則可能在相當長的時間內(nèi)留存在動物可食組織中［8－9］。目前，歐盟國家要求以代謝產(chǎn)物為目標分析物以達到檢測硝基呋喃殘留的目的。硝基呋喃類藥物及其對應(yīng)的代謝產(chǎn)物有呋喃唑酮(3－amino－2－oxaolidone，AOZ)、呋喃它酮(5－morpholino－3－amino－2－oxazolidone，AMOZ)、氨基脲(semicabazide，SEM)和氨基海因(1 － aminohydantoin，AHD)［10－11］。硝基呋喃代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、SEM、AHD可在酸性條件下水解，同時可用2－硝基苯甲醛(2－nitrobenzaldehyde，NBA)衍生化，其相應(yīng)衍生物分別是呋喃唑酮代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NPAOZ、呋喃它酮代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AMOZ、呋喃西林代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－SEM、呋喃妥因代謝物的2－硝基苯甲醛衍生物2－NP－AHD，經(jīng)提取和進一步凈化后，殘留量可用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LC－MS/MS)進行檢測［12－13］。

3 LC-MS/MS在硝基呋喃類獸藥檢測中的應(yīng)用

林黎明等［14］提出采用乙酸乙酯提取，再用自行配制的液體凈化試劑進行凈化，可適用于各種動物組織的提取凈化，方法簡單、快速、廉價;采用LC－MS/MS多重反應(yīng)監(jiān)測，對4種代謝產(chǎn)物通過一級質(zhì)譜分別選擇其分子離子作為分母離子，與氣體碰撞后，再經(jīng)二級質(zhì)譜分別選擇兩對子離子，進行定性定量測定;研究發(fā)現(xiàn)，對每一待測成分的兩對監(jiān)測離子進行組合后，可更有效地利用串聯(lián)質(zhì)譜的定性和定量信息，改善了信噪比，提高了定量檢測的靈敏度。結(jié)果實際測定樣品為FAPAS國際水平測試樣品，樣品基質(zhì)為豬腎，其中含有1～4種硝基呋喃代謝產(chǎn)物，稱取5.0 g樣品2份，按上述分析方法進行操作，共檢測出兩種代謝物，分別為AMOZ和 AHD，含量分別為 1.9、0.76 μg/kg，添加回收率分別為68.2%和91.9%。

國內(nèi)的丁濤等［15－17］使用了 LC －MS/MS測定蜂王漿和蜜蜂中 AOZ、AMOZ、SEM、AHD 4種硝基呋喃類藥物代謝殘留物的方法。以三氯乙酸作為蜂王漿的蛋白質(zhì)沉淀劑，同時提供衍生化反應(yīng)所需的酸性環(huán)境。實驗結(jié)果表明，呋喃它酮代謝物的檢測下限可以達到0.03 μg/kg，其他3種硝基呋喃類藥物的代謝物的檢測下限可以達到0.05 μg/kg，呋喃它酮代謝物的定量下限可以達到0.20 μg/kg，其他3種硝基呋喃類藥物的代謝物的定量下限可以達到0.25 μg/kg，線性范圍為0.4 ～20 ng/mL，添加回收率為97.7% ～104.8%(內(nèi)標校正)，相對標準偏差(RSD)為 2.7% ～9.7%。

祝偉霞等［18－19］建立了動物性食品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因代謝物的測定方法，在酸性條件下水解，2－NBA進行衍生化，乙酸乙酯提取，固相萃取柱Oasis HLB富集凈化，三級四極串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜正離子模式測定，同位素內(nèi)標定量。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定性準確可靠。通過對實際樣品的檢測，證明可用于動物源性食品中四種硝基呋喃代謝物殘留的測定。

彭濤等［20－21］采用 LC －MS/MS同時測定奶粉中AOZ、AMOZ、SEM、AHD代謝物。鹽酸水解奶粉中蛋白結(jié)合的代謝物，同時加入2－NBA，37℃過夜衍生化。加入硫酸鋅，調(diào)pH值至7.0后，再加入亞鐵氰化鉀去除蛋白。后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離正離子(ESI+)、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，內(nèi)標法定量。在添加濃度0.5 ～2 μg/kg 范圍內(nèi)，內(nèi)標法回收率為 89.5% ～110.3%;相對標準偏差(RSD)小于 11.3%。AMOZ、AOZ 檢出限為 0.05 μg/kg，SEM、AHD 為0.1 μg/kg。

趙善倉等［22］建立和發(fā)展了畜產(chǎn)品4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留的LC－MS/MS快速檢測方法，樣品中與蛋白結(jié)合的代謝物經(jīng)0.125 mol/L鹽酸水解，2－NBA在37℃衍生16 h。上清液調(diào)節(jié)pH=7.4，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，流動相定容。外標法定量，在添加濃度為 0.1～2.0 μg/kg范圍內(nèi)，4種代謝物的平均回收率在67.3% ～85.0%之間，10次測定結(jié)果的 RSD平均值在2.0% ～9.7% 之間。最低檢出限均達到 0.15 μg/kg，在0.10 ～20.00 ng/mL 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，實現(xiàn)了樣品檢測的快速、高靈敏和高的選擇性，適用于畜產(chǎn)品豬肉和豬肝中硝基呋喃類代謝物殘留的檢測。

隨著硝基呋喃類獸藥殘留越來越引起人們的重視，國外一些專家和機構(gòu)紛紛研究此類藥物殘留的檢測方法，力求使最低檢測限達到最低。如Conneely A等［23］采用LC－MS/MS測定了豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的殘留量。樣品的凈化過程采用過2次SPE柱的方法，其中的雜質(zhì)和衍生化試劑干擾可以大大地降低。該方法在5.25 ng/g添加濃度下的回收率分別為(84±19.2)%和(90±16.3)%。2005年，他們進一步研究了4種NFs(硝基呋喃類藥物)在豬體內(nèi)的代謝機理，并建立了豬肉、豬肝和豬腎中4種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留量的LC－MS/MS方法。他們通過給豬直接飼喂含四種硝基呋喃類添加劑的飼料，分別測定其藥物原形和代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，動物組織中基本上未檢出原形藥物，而其代謝物的含量卻非常高，4種藥物的代謝物在豬體內(nèi)非常穩(wěn)定，停藥6個星期后依然可以被檢測出。

Leimer P等［24］建立了同時測定動物組織中4種硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留量的LC－MS/MS方法。樣品經(jīng)過聚苯乙烯SPE柱凈化后，藥物經(jīng)水解與組織蛋白離解開，即與2－硝基苯甲醛發(fā)生衍生化，形成相對穩(wěn)定的化合物。以2－硝基苯甲醛縮氨基脲為內(nèi)標，在衍生化結(jié)束后加入樣品中，以考察基質(zhì)的離子抑制效應(yīng)。使用ESI正離子模式進行監(jiān)測時，檢出限在0.5 ng/g，而定量限在2.5～10 ng/kg之間，其定性定量均可滿足歐盟要求。

國外使用穩(wěn)定同位素標記化合物作為內(nèi)標物進行定量和定性的分析也在逐漸推廣使用。如Effkemann等［25］采用穩(wěn)定性同位素雙標化合物［1，2－15N，13C］－SEM 作為內(nèi)標物質(zhì)，研究了測定動物組織和雞蛋中呋喃西林代謝物的方法，方法檢測限為10 μg/kg;Khong等［26］以穩(wěn)定性同位素氘代化合物(d4－SEM等)為內(nèi)標物質(zhì)，建立了通過質(zhì)譜方法測定蜂蜜中四種呋喃類獸藥殘留代謝物的方法，方法最終檢測限范圍在 0.12 ～0.56 μg/kg，定量限范圍在0.07 ～0.46 μg/kg，檢測誤差可控制在18%以內(nèi);Becalski等［27］以穩(wěn)定性同位素雙標化合物13C，15N2－Semicarbazide作為內(nèi)標物質(zhì)，通過LC－MS/MS測定動物組織中呋喃西林代謝物的方法，方法檢測限確定為 0.1 μg/kg;Mottier P 等［28］建立了基于同位素稀釋技術(shù)的4種硝基呋喃類獸藥殘留檢測方法。在酸性條件下把與蛋白結(jié)合的硝基呋喃類代謝物離解后，與2－NBA結(jié)合生成較為穩(wěn)定的化合物。經(jīng)液液萃取和固相萃取凈化后，進行LC－ESI－MS/MS分析，方法對雞肌肉中按歐盟的要求進行了驗證試驗，檢出限在0.11～0.21 μg/kg，而定量限在0.19 ～0.36 μg/kg。

4 硝基呋喃類藥物檢測存在的問題及展望

目前動物性食品中硝基呋喃類藥物檢測存在著樣品前處理繁瑣，試劑用量大，檢測儀器昂貴，陽性率高等問題。硝基呋喃類檢測的研究重點是在不需要衍生化步驟的情況下，直接檢測其代謝物來減少分析時間和成本。硝基呋喃類藥物殘留研究的另一方向是建立快速ELISA法，但目前商品化試劑盒只有單克隆抗體，若成功開發(fā)出4種呋喃類藥物的抗體檢測試劑盒，則能使硝基呋喃代謝物檢測達到簡便、快速、成本低廉、特異性強的目的。

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