超聲聯(lián)合微泡開放血-腦屏障及其影像學(xué)評價的研究進(jìn)展

陳路鋒 綜述 張 震 徐 克 審校

2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲診斷科，遼寧省影像診斷與介入治療重點實驗室 遼寧沈陽 110001

血-腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是存在于血液和腦組織間的一種生物屏障系統(tǒng)，BBB通過限制大分子物質(zhì)甚至許多小分子物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織而對腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。病理情況下，由于BBB的存在，許多治療藥物或診斷試劑也難以進(jìn)入腦組織發(fā)揮作用。因此，如何安全、可逆地開放BBB，促進(jìn)藥物向腦組織內(nèi)轉(zhuǎn)運，使藥物在腦組織內(nèi)達(dá)到更大的濃度而發(fā)揮藥效，對腦內(nèi)疾病的診斷和治療有重要意義。靜脈給予超聲微泡造影劑時，用超聲照射腦組織可以使照射區(qū)域局部腦組織的BBB可逆開放，并且具有安全、穩(wěn)定、無創(chuàng)、靶向等優(yōu)點，為開放BBB提供了一種新的手段。本文就該技術(shù)的發(fā)展及其影像學(xué)評價作一綜述。

1 超聲對BBB的作用

最早在研究高強度聚集超聲治療腦部疾病時發(fā)現(xiàn)，除消融作用外，聚焦超聲（focused ultrasound，F(xiàn)US）還可使BBB局部開放，而對腦組織無嚴(yán)重?fù)p傷[1]，為使用無創(chuàng)手段開放BBB提供了新的方法。但是如何能穩(wěn)定地達(dá)到BBB開放的效果，而又對受照射腦組織沒有明顯損傷，一直未能找到合適的超聲參數(shù)。Ballantine等[2]發(fā)現(xiàn)，使用脈沖式高強度超聲波照射腦組織，可降低對周圍腦組織的損傷，并提出了FUS開放BBB的可能機制涉及空化效應(yīng)。然而這種方法仍然不能穩(wěn)定地開放BBB。直到2001年，Hynynen等[3]發(fā)現(xiàn)在使用FUS照射的同時聯(lián)合靜脈給予超聲微泡造影劑，通過超聲與微泡的相互作用可穩(wěn)定實現(xiàn)開放BBB的效果，而且使所需FUS的強度大幅下降。此后，大量研究開始使用脈沖式聚焦超聲聯(lián)合微泡開放BBB，并探索FUS參數(shù)及微泡劑量對其效應(yīng)的影響。

FUS強度的大小可以影響FUS的照射效果，超聲強度過低不能開放BBB，而過高強度的超聲造成的損傷也增加。影響超聲照射強度的參數(shù)主要有超聲的頻率、照射靶點處的負(fù)峰值聲壓（指在聲波重復(fù)周期內(nèi)，聲場中或特定平面處負(fù)值瞬時聲壓的最大值，簡稱聲壓幅值）、超聲的脈沖持續(xù)時間、照射時間、微泡的劑量與大小等。動物實驗結(jié)果顯示，這些參數(shù)的取值越大，BBB的開放程度越大，同時也更容易造成腦組織損傷[4-8]。研究顯示，使用260kHz的FUS聯(lián)合微泡在不同聲壓幅值（0.1～0.9MPa）條件下照射20s，在0.2MPa以上時才能觀察到BBB開放，而0.4MPa可開放90%的照射區(qū)，同時0.4MPa以上時紅細(xì)胞外滲也明顯增加[8]。超聲的頻率和聲壓幅值是其中最重要的兩個參數(shù)。McDannold等[9]總結(jié)了其他條件相似、而使用的頻率和聲壓幅值不同的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)使用不同頻率的超聲照射達(dá)到相似的效果，與其所需要的超聲強度存在一定關(guān)系。他們將使50%的照射區(qū)BBB開放所需的聲壓幅值作為聲壓閾值，比較了在0.26、0.69、1.5、1.63、2.1MHz 5個頻率下照射腦組織時的聲壓閾值，發(fā)現(xiàn)二者存在a＝T/f0.48（T為聲壓閾值，f為探頭頻率，a為常數(shù)）的關(guān)系，這與平時所用的超聲參數(shù)機械指數(shù)（MI）＝T/f0.5接近，用MI表示二者之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)各個頻率下其MI值均在0.46左右。MI值是相對容易獲得的超聲參數(shù)，達(dá)到相似效應(yīng)所需頻率和聲壓之間的關(guān)系符合MI，這不僅為超聲參數(shù)的選擇提供了相對簡便的指標(biāo)，而且大大方便了不同條件下超聲效果的比較。當(dāng)然在其他參數(shù)下，二者之間是否還符合MI的關(guān)系，是否能用MI作為超聲效應(yīng)的指標(biāo)還有待總結(jié)。

目前研究中使用的超聲探頭主要為較低頻率的探頭（2.04MHz以下），而臨床常用的診斷超聲探頭頻率均比較高。Bing等[10]使用頻率為5～8MHz的臨床診斷用超聲探頭聯(lián)合微泡造影劑對小鼠經(jīng)顱照射，通過對不同參數(shù)的選擇，成功開放了BBB，并可用增強MRI顯示。由于診斷頻率探頭在臨床中相對容易獲得，因此，診斷頻率探頭的應(yīng)用將使該技術(shù)的臨床使用更為方便。

US聯(lián)合微泡可以無創(chuàng)開放BBB，而且對照射組織無明顯損傷，其確切機制尚不清楚。組織學(xué)觀察到在使用較低能量（0.55W）照射腦組織后，毛細(xì)血管內(nèi)皮可見到囊泡和空泡增多，穿孔或通道形成，一些緊密連接開放，而且上述結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)有示蹤分子。而使用較高能量（3W）照射后則出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞破壞，標(biāo)記的免疫球蛋白可經(jīng)內(nèi)皮缺損處漏出[11]。總之，超聲照射后血管內(nèi)的物質(zhì)可以通過經(jīng)內(nèi)皮旁和經(jīng)內(nèi)皮途徑進(jìn)入腦組織，說明該過程涉及多種機制。當(dāng)監(jiān)測受照腦組織的溫度僅升高0.025℃即可使BBB開放，說明溫度效應(yīng)并不是超聲開放BBB的主要機制[12]。目前認(rèn)為超聲聯(lián)合微泡使BBB通透性改變的過程涉及空化效應(yīng)和聲輻射力效應(yīng)。引入的微泡作為空化核，在超聲作用下振動，體積產(chǎn)生膨脹及收縮，甚至崩潰，增強了空化效應(yīng)。而聲輻射力使得微泡在聲波傳播方向上移動，使其與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸，對內(nèi)皮產(chǎn)生牽拉。在超聲與微泡的相互作用過程中，微泡體積的變化，微泡周圍產(chǎn)生的微小渦流及對內(nèi)皮的牽拉，使得內(nèi)皮之間的緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，局部微血管血流短暫下降，內(nèi)皮上一些機械敏感或牽拉敏感性離子通道開放，這些改變共同造成BBB通透性增加[12-14]?？栈?yīng)分為穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化，而微泡在超聲場中發(fā)生瞬態(tài)空化時可以產(chǎn)生高溫、高壓、高速微射流等劇烈的物理反應(yīng)，可產(chǎn)生明顯的生物學(xué)效應(yīng)，曾認(rèn)為可能在超聲開放BBB中發(fā)揮重要作用。在選用適當(dāng)參數(shù)，使得不能產(chǎn)生瞬態(tài)空化效應(yīng)時，仍然可以使BBB開放[13]。進(jìn)一步研究顯示，超聲照射腦組織開放BBB所需的聲壓閾值略低于瞬態(tài)空化的聲壓閾值，在這兩個閾值之間的聲壓可以不產(chǎn)生瞬態(tài)空化而開放BBB[15]?？梢娝矐B(tài)空化效應(yīng)并不是BBB開放所必需的。US聯(lián)合微泡開放BBB的機制可能是多種效應(yīng)共同作用的結(jié)果，有待進(jìn)一步研究。

2 超聲開放BBB的離體評價

BBB開放或受損后可以用多種方法進(jìn)行觀察和檢測。組織學(xué)方法可以在光鏡或電鏡下觀察內(nèi)皮、基底膜等BBB構(gòu)成結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，有無紅細(xì)胞外滲或出血及神經(jīng)元損傷等。腦脊液取樣法通過測定腦脊液中的蛋白質(zhì)含量，可以間接反映BBB受損情況。向血管內(nèi)引入熒光標(biāo)記物，在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記物在血管內(nèi)外的分布情況，可以判斷BBB是否可以開放。此外，還有伊文思蘭法和定量放射自顯影法，其中伊文思蘭法是FUS開放BBB的研究中使用最多的離體評價方法。

2.1 伊文思蘭法 伊文思蘭（Evans blue，EB）是一種藍(lán)色染料，不能通過正常的BBB，入血后與白蛋白結(jié)合形成復(fù)合物（ESA），并可在血中存在數(shù)小時。超聲照射腦組織后，經(jīng)左心室灌注EB，直至右心房流出的液體變清亮后切取腦組織。超聲照射導(dǎo)致BBB開放的區(qū)域可觀察到腦組織藍(lán)染。取材后浸入50%三氯醋酸溶液，取浸出液用分光光度計（λ＝620nm）測定其吸光度，計算出腦組織滲出的EB的量，從而可以定量評價BBB開放的程度[3,16]。

2.2 定量放射自顯影法 超聲對腦組織照射后，引入放射性核素示蹤劑，對腦組織進(jìn)行定影、顯影后，檢測出單位腦組織的放射性活性濃度，則可反映核素經(jīng)過開放的BBB進(jìn)入腦組織的量。在相同條件下用不同強度超聲照射后，照射區(qū)腦組織的放射性活性隨超聲強度的增大而增加，0.78MPa時為平均值0.017% ID/ml，而2.45MPa時為0.134%ID/ml，說明放射性活性可以反映BBB的開放程度[17]。

3 在體影像學(xué)評價

離體監(jiān)測BBB通透性的方法必需在處死動物后取材測定進(jìn)行檢測，不能在活體狀態(tài)下觀察，也不能進(jìn)行后續(xù)的隨訪觀察。用影像學(xué)方法在體觀察BBB開放不僅有助于超聲對BBB影響效應(yīng)的研究，也是該技術(shù)真正得以臨床應(yīng)用所必需。

3.1 MRI在監(jiān)測超聲開放BBB中的使用 由于MRI有良好的組織對比度，不僅有利于治療靶點的確定，也有助于觀察超聲處理后的組織改變，是目前超聲開放BBB研究中使用最多的影像學(xué)手段。正常BBB完整時，磁共振造影劑Gd-DTPA不能通過，所以正常腦組織增強時強化不明顯。而BBB受到破壞后，造影劑可以由血管內(nèi)進(jìn)入腦實質(zhì)，從而使腦組織強化。

Hynynen等[3]首先在超聲開放BBB的研究中使用增強MRI進(jìn)行監(jiān)測。在FUS照射靶區(qū)腦組織后，行增強MRI，發(fā)現(xiàn)照射區(qū)腦組織較對照區(qū)強化。之后，許多超聲開放BBB的研究開始使用MRI作為在體監(jiān)測方法。

3.1.1 在超聲照射條件選擇中的應(yīng)用 Hynynen等[18]用MRI是否增強判斷BBB是否開放，研究超聲聯(lián)合微泡在不同聲壓幅值時開放BBB的能力。結(jié)果顯示，0.4MPa時有50%的照射區(qū)MRI出現(xiàn)強化，而1.4MPa的聲壓條件照射后所有照射區(qū)都發(fā)生強化。Chopra等[7]用增強MRI監(jiān)測BBB開放，研究1.08MHz脈沖超聲聯(lián)合微泡對腦組織的影響，結(jié)果顯示，在0.38MPa條件下，照射時間超過300s時會出現(xiàn)不可逆損傷。McDannold等[19]則在MRI監(jiān)視下，研究不同聲壓條件下FUS對腦組織的損傷。

3.1.2 在對出血的識別與鑒別中的應(yīng)用 隨著對超聲條件的探索，超聲強度的降低及超聲微泡造影劑的使用大大降低了照射時對腦組織的損傷。但是仍可能出現(xiàn)微出血、紅細(xì)胞外滲甚至較大范圍出血等反應(yīng)。目前常用的增強T1加權(quán)成像雖然可以檢測出超聲照射后BBB通透性的改變，但對可能發(fā)生的微出血卻不敏感。Liu等[20]在對大鼠實驗中比較了T2WI、增強T1WI及磁敏感加權(quán)（SWI）三種成像序列，發(fā)現(xiàn)SWI對微出血更為敏感，且可以用于組織損傷后的恢復(fù)過程。T2WI對FUS照射所致微出血的檢測與SWI的敏感性相似[21]。對超聲開放BBB后，在注射SPIO前后各做一次T2WI，可分別顯示出血及BBB開放區(qū)，可以對二者鑒別，而兩次成像的不匹配區(qū)域則為安全開放的區(qū)域[22]。

3.1.3 MRI對BBB開放程度的評價 MRI是否強化只能定性判斷BBB是否開放。但如何在體判斷BBB的開放程度是真正實現(xiàn)影像學(xué)監(jiān)測所必需的。BBB破壞后，造影劑增強的強度與離體檢測的EB滲出量呈正相關(guān)。MRI增強掃描腦組織較平掃的信號增加幅度可反映BBB的開放程度[23]。近來有學(xué)者將該方法用于FUS誘導(dǎo)的BBB開放的研究中。Yang等[16]在用FUS照射大鼠后0min、10min、20min、40min、60min 5個時間點行SE序列T1加權(quán)成像，分析標(biāo)化后的信號增強幅度與EB滲出量的相關(guān)性，結(jié)果顯示各時間點二者均呈明顯相關(guān)，10min時間點的相關(guān)性最高（r＝0.864），10min以后r值逐漸下降。Vlachos等[24]利用動態(tài)增強MRI定量計算超聲照射后的小鼠腦的空間通透性，從血流動力學(xué)角度直接量化照射區(qū)通透性。在FUS聯(lián)合微泡處理后，注射MRI造影劑行動態(tài)掃描，獲得直觀的通透性圖，并計算表征通透性的參數(shù)Ktrans。用普通動力學(xué)模型和參考區(qū)域模型得到的Ktrans值分別為（0.02±0.0123）/min和（0.03±0.0167）/min，均比正常區(qū)域高2個數(shù)量級，且兩個模型得到的Ktrans值基本一致（r＝ 0.97）。

3.2 核醫(yī)學(xué)影像在監(jiān)測開放BBB中的使用99Tcm-DTPA與Gd-DTPA具有相似的藥代動力學(xué)特性，為非彌散性示蹤劑，是核醫(yī)學(xué)中測量BBB完整性的經(jīng)典示蹤劑。BBB受到破壞時，99Tcm-DTPA經(jīng)血管進(jìn)入腦實質(zhì)，經(jīng)核醫(yī)學(xué)成像設(shè)備檢查出腦組織的放射性活性，得到功能圖像，通過放射性活性值定量判斷BBB的完整性。目前99Tcm-DTPA已廣泛用于人體腦腫瘤、中風(fēng)等疾病時BBB完整性的檢測。用SPECT/CT對FUS處理后的大鼠定量分析顯示，99Tcm-DTPA的濃聚與放射自顯影結(jié)果一致，BBB的破壞指數(shù)（disruption index，DI，即病變區(qū)計數(shù)與正常腦組織放射活性計數(shù)的比值）在超聲照射后90min時達(dá)到高峰[17]。對鼠腦膠質(zhì)瘤模型用FUS照射，SPECT/CT檢查發(fā)現(xiàn)99Tcm-DTPA的攝取量明顯增加，但攝取特點與正常鼠被FUS照射后不同，且DI到達(dá)峰值的時間稍長[25]。用SPECT/CT分析99Tcm-DTPA的藥代動力學(xué)特點，不僅可以定量評價超聲所致的BBB開放程度，而且對超聲照射后給藥方案的確定有很大幫助。

4 總結(jié)與展望

目前微泡介導(dǎo)超聲開放BBB已用于動物疾病模型的藥物治療研究。阿爾茨海默病模型鼠和腦膠質(zhì)瘤鼠模型動物實驗顯示，該方法可以開放病區(qū)腦組織的BBB，并可促進(jìn)藥物向病變組織轉(zhuǎn)運[26,27]。近來對超聲照射參數(shù)的選擇及該方法的安全性和有效性方面已經(jīng)做了很多研究，技術(shù)方法已較為成熟。但用在體影像學(xué)方法定量評價超聲照射后BBB開放程度的研究還較少。另外，影像學(xué)定量指標(biāo)在評估與預(yù)測療效中的意義尚有待進(jìn)一步研究。

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