動(dòng)物基因定位的發(fā)展及其分子遺傳標(biāo)記

張建軍 薛科邦 茍想珍 疇 鑫 謝文章

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅，平?jīng)?744000；2.甘肅省華池縣畜牧獸醫(yī)站，甘肅，華池 745600；3.甘肅省環(huán)縣畜禽改良站，甘肅，環(huán)縣 745700）

近些年來，世界上的一些發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)動(dòng)物基因定位的研究給予極大的重視，撥出較多的資金，開展了一系列較系統(tǒng)的研究，自中、美、日、德、法、英國(guó)科學(xué)家聯(lián)合宣布，他們繪制出了準(zhǔn)確、清晰、完整的人類基因組圖譜，標(biāo)志著生命科學(xué)又向縱深邁進(jìn)了一步。同時(shí)，隨著分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的更加成熟，這一重大成果也使動(dòng)物的基因定位研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新發(fā)展的時(shí)期。

1 動(dòng)物基因定位研究動(dòng)態(tài)

動(dòng)物基因定位研究被認(rèn)為是未來動(dòng)物分子育種的基石。由此，建立起來的DNA標(biāo)記技術(shù)是未來動(dòng)物育種的主要工具。動(dòng)物基因定位的目標(biāo)就是要在DNA水平上，確定控制經(jīng)濟(jì)重要性狀座位。基因定位研究結(jié)果具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，國(guó)際著名數(shù)量遺傳學(xué)家Soller估計(jì)基因定位技術(shù)可使奶牛年產(chǎn)奶量在短時(shí)間內(nèi)增加3 000 kg；而英國(guó)著名遺傳育種學(xué)家haley認(rèn)為基因定位技術(shù)可在本世紀(jì)末使豬產(chǎn)仔數(shù)增加1頭，其純利對(duì)英國(guó)養(yǎng)豬業(yè)而言是7億英鎊。動(dòng)物基因定位是未來動(dòng)物品種改良的主要手段，特別是要在未來持續(xù)增加產(chǎn)量和改進(jìn)質(zhì)量以及迅速響應(yīng)市場(chǎng)方面，只有分子育種才能快速做到，因此各個(gè)國(guó)家都將動(dòng)物基因定位研究納入國(guó)家重大優(yōu)先研究項(xiàng)目。

歐洲豬基因定位計(jì)劃（pig genome，project，pigmap）制定于1989年，并在1990年正式啟動(dòng)，有歐共體10個(gè)國(guó)家的16個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加1993年，為了加強(qiáng)與美國(guó)和日本的競(jìng)爭(zhēng)能力，歐洲Pigmap計(jì)劃向其他非歐共體國(guó)家開放，參加的國(guó)家數(shù)增至14個(gè)，實(shí)驗(yàn)室數(shù)增至22個(gè)。Pigmap實(shí)施至今，發(fā)表了近500篇高水平論文，獲得了28項(xiàng)專，帶動(dòng)了世界動(dòng)物基因定位研究的發(fā)展。

美國(guó)是世界上開展動(dòng)物基因定位研究最早的國(guó)家，但在1991年前都是些零散的研究活動(dòng)。1991年美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）同時(shí)資助啟動(dòng)了美國(guó)的豬、牛和雞基因定位計(jì)劃，即著名的“國(guó)家動(dòng)物基因組研究計(jì)劃”，由農(nóng)業(yè)部直接領(lǐng)導(dǎo)，各個(gè)物種都成立了相應(yīng)的協(xié)作委員會(huì)，各委員會(huì)又設(shè)1～2個(gè)著名科學(xué)家作為負(fù)責(zé)人。

我國(guó)動(dòng)物生物技術(shù)研究與開發(fā)起步較晚，但在近年來卻取得了很大的成績(jī)，特別是在我國(guó)863計(jì)劃的支持下，已逐步由單純的模仿開始了自主創(chuàng)新，一批以動(dòng)物生物技術(shù)為核心技術(shù)的企業(yè)也正在發(fā)展壯大。1999年我國(guó)有一定動(dòng)物生物技術(shù)研究與開發(fā)規(guī)模的公司是21家，總產(chǎn)值不超過 8 500萬(wàn)人民幣，然而政府與企業(yè)累計(jì)共同投入的研究與開發(fā)經(jīng)費(fèi)卻達(dá)到1.6 億人民幣。主要資助和正在開展的研究有鹿、牛、黃鱔性別基因定位，家豬毛色基因定位，雞性連鎖矮小基因的定位，太湖豬高繁殖力基因的定位，豬、雞數(shù)量性狀的基因定位等。

2 DNA分子遺傳標(biāo)記

DNA 分子標(biāo)記主要是指 DNA 水平上的變異。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，DNA 分子標(biāo)記開始得到應(yīng)用，通過測(cè)定遺傳物質(zhì)DNA 本身的變異，為遺傳多樣性檢測(cè)提供一系列更加直接有效的途徑，為基因的定位和改良提供了技術(shù)保障?；蚨ㄎ患夹g(shù)主要是找到影響數(shù)量性狀位點(diǎn) （quantitative trait loci，QTL）中的主效基因，或與有連鎖關(guān)系的DNA標(biāo)記，通過標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行定向育種；基因改良是通轉(zhuǎn)基因技術(shù)將產(chǎn)生特定性狀的外源性基因?qū)氲絼?dòng)物基因組上，從而達(dá)到改良重要生產(chǎn)性狀或非常規(guī)性育種性狀的目標(biāo)。目前，在動(dòng)物基因定位和改良上應(yīng)用較廣泛的分子遺傳標(biāo)記有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析技術(shù)、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記等。

2.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)標(biāo)記（RFLP）

RFLP標(biāo)記是指用限制性內(nèi)切酶切割不同個(gè)體基因組DNA后，含同源序列的酶切片段在長(zhǎng)度上的差異。其多態(tài)性產(chǎn)生的原因是DNA 某區(qū)域發(fā)生缺失、插入、突變引起酶切位點(diǎn)的消失、出現(xiàn)、位移或染色體重排引起電泳帶改變。RFLP 的探針有 cDNA 探針和基因組 DNA 探針，前者有較強(qiáng)的保守性，可用于基因組比較和種群起源演化；后者檢測(cè)的多態(tài)頻率較高，但種屬特異性強(qiáng)。RFLP標(biāo)記的是單拷貝編碼序列，大多數(shù)屬單位點(diǎn)上的雙位點(diǎn)基因，具有共顯性特點(diǎn)，因此主要用于遺傳連鎖圖的繪制和目的基因的標(biāo)記。

2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（RAPD）

RAPD以基因組 DNA 為模板，利用非特異性寡核甘酸為引物（5～10 bp），通過DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因組。該類標(biāo)記能檢測(cè)到多個(gè)基因座位，多態(tài)信息含量變化范圍大（0.2～0.9），可在對(duì)物種沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下進(jìn)行多態(tài)性分析。所用引物可人工合成，適用于生物界的不同物種。RAPD技術(shù)是在1990年由William和Welsh等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法。RAPD標(biāo)記比RFLP具有簡(jiǎn)便、快捷和多態(tài)性檢出率高等特點(diǎn)，其主要應(yīng)用于目標(biāo)基因標(biāo)記、遺傳資源鑒定及分類。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）

AFLP 的檢測(cè)原理是使用雙鏈人工接頭與基因組DNA 酶切片段相連接作為擴(kuò)增的模板，對(duì)酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。由于不同來源的 DNA 酶切片段存在差異，導(dǎo)致產(chǎn)生的產(chǎn)物呈多態(tài)性。AFLP 實(shí)際是 RFLP 與PCR 相結(jié)合的一種技術(shù)，具多態(tài)性強(qiáng)，一般可檢測(cè) 40～150 個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，非常適合繪制品種的指紋圖譜及分類研究；穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)以及樣品適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。

2.4 單核苷酸多態(tài)性（SNPS）

SNPS是1996 年美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的 E.S. Lander 提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、插入及缺失等形式，目前，SNP標(biāo)記主要用于基因作圖、人類疾病相關(guān)基因及藥物設(shè)計(jì)研究等方面。隨著分子標(biāo)記技術(shù)與各種生物技術(shù)的結(jié)合，在對(duì)家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳機(jī)理的分析、目的基因的篩選和定位，選擇效率的提高、種質(zhì)資源的保護(hù)研究和有效利用中，SNPs 標(biāo)記技術(shù)將發(fā)揮巨大的作用。

2.5 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

SSCP其原理是單鏈 DNA 片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來維持的，相同長(zhǎng)度的單鏈 DNA 當(dāng)有一個(gè)堿基或者多個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，就會(huì)影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，在中性聚丙烯酰胺凝膠中其遷移率不一樣，將不同遷移率的個(gè)體測(cè)序，可以非常準(zhǔn)確地將構(gòu)象上有差異的分子分別開來。單鏈構(gòu)象多態(tài)性最初是1984 年由 Noumi 等對(duì)正常和突變的大腸桿菌 F1-ATPase 基因進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種探測(cè)基因點(diǎn)突變的方法。1989 年，Orita將探針雜交和放射自顯影技術(shù)應(yīng)用到 SSCP 中。同年 Orita 等將 PCR 同 SSCP 相結(jié)合，使檢測(cè)的靈敏度大大提高，并省去酶切等步驟，從而避免了先前采用基因組 DNA 特異性不強(qiáng)的缺陷。

3 展望

DNA分子標(biāo)記的產(chǎn)生并應(yīng)用于動(dòng)物育種實(shí)踐開創(chuàng)了動(dòng)物基因定位和改良的新領(lǐng)域，大多數(shù)科學(xué)家和企業(yè)家都相信，動(dòng)物基因定位研究將在21世紀(jì)形成低投入、高產(chǎn)出的巨大產(chǎn)業(yè)，是動(dòng)物育種中最充滿活力和前景最為燦爛的高新技術(shù)。在實(shí)際應(yīng)用中將各種分子遺傳標(biāo)記相互結(jié)合，相互補(bǔ)充，可以從各個(gè)角度更深入全面地了解動(dòng)物的本質(zhì)，通過研究動(dòng)物的遺傳結(jié)構(gòu)和控制機(jī)制，更好地揭示遺傳結(jié)構(gòu)和功能的內(nèi)在聯(lián)系，使動(dòng)物定向培育的前景更加光明。

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