畜牧獸醫(yī)科技文摘

健康奶牛與臨床型乳腺炎奶牛乳腺線粒體蛋白組差異表達分析/王建鋒（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070），陶金忠，張 勇…//中國獸醫(yī)學報.-2012，32(1).-63～68

運用亞細胞蛋白質組學的研究策略，分離純化亞細胞結構再進行蛋白質組學研究，可提高低豐度蛋白在雙向凝膠電泳中的檢出率。通過對比分析乳腺炎奶牛乳腺與正常奶牛乳腺線粒體蛋白質組的表達變化，為奶牛乳腺炎的生物學治療及抗病育種工作篩選出目基因和蛋白。超速離心法分離線粒體，雙向凝膠電泳分離蛋白，PDQuest7．4軟件分析差異蛋白斑點，高效液相色譜串聯(lián)離子阱質譜鑒定差異蛋白。從奶牛乳腺線粒體蛋白2－DE圖譜中篩選出17個差異表達的蛋白質斑點，質譜鑒定出17個差異表達蛋白（6個蛋白在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中下調，8個上調，1個只在正常情況下表達，2個只在乳腺炎乳腺組織中表達）。篩選出的差異蛋白質涉及到細胞的能量代謝、蛋白質合成、mRNA的加工成熟及調亡調控等許多方面，表明奶牛乳腺炎發(fā)生時乳腺線粒體組織結構和代謝狀態(tài)都發(fā)生了明顯的變化。

一種直接用于PCR 擴增的山羊瘤胃微生物DNA 提取方法的建立/許發(fā)芝（安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥 230036），吳勝國，李呂木…//中國微生態(tài)雜志.-2012，24(1).-66～68

目的建立提取高質量的瘤胃微生物DNA 的方法，為采用免培養(yǎng)技術研究山羊瘤胃微生物奠定基礎。方法：采集山羊瘤胃內容物，用SDS 高鹽法提取微生物總DNA，以通用引物擴增細菌和古細菌的16S rDNA。結果提取到的瘤胃微生物總DNA 片段大于23 kb，PCR 能夠擴增出細菌和古細菌的16S rDNA 片段。結論用該提取方法得到的山羊瘤胃微生物總DNA 能夠滿足后續(xù)實驗的需要。

鴨毛囊中ASIP基因片段的克隆及組織表達分析/梁正翠（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009），楊海明，王志躍…//中國獸醫(yī)學報.-2011,31(6).-864～869

根據(jù)GenBank發(fā)表的雞刺鼠信號蛋白(ASIP)基因序列的同源保守區(qū)域,設計了1對特異性引物。以番鴨、高郵鴨和英系北京鴨(即櫻桃谷鴨)毛囊RNA為模板,經(jīng)擴增、測序及拼接得到的部分mRNA序列均為編碼序列,共308bp,對應編碼102個氨基酸。與已發(fā)表的原雞和鵪鶉的ASIP對應的mRNA核苷酸序列進行比對,番鴨、高郵鴨和英系北京鴨的同源性均在92.53%以上,相應編碼的氨基酸序列同源性均高于92.16%。高郵鴨與英系北京鴨核苷酸,氨基酸序列一致,同源性為100%。半定量PCR結果顯示,番鴨ASIP基因表達具有較高的普遍性,在皮膚組織(毛囊和皮膚)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(下丘腦)及其他非皮膚中均有表達。皮膚和毛囊的表達差異不顯著(P＞0.05),下丘腦中的ASIP基因相對表達量最高,極顯著高于皮膚中ASIP基因的表達量(P＜0.01),而與毛囊中的差異不顯著(P＞0.05)。

奶山羊BLG基因敲除載體的構建/陳華濤（西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部動物生殖生理和胚胎工程重點開放實驗室，陜西 楊凌 712100），李倩，胡林勇…//中國獸醫(yī)學報.-2011，31(6).-858～863

根據(jù)已知的BLG序列設計引物,通過PCR技術克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外顯子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外顯子3、4、5、6、7,分別連入克隆載體pMD18-T Simple載體中并測序。然后以含有正負篩選標記基因的ploxpⅡ載體為基礎,將5′端和3′端同源臂片段先后連入其中,進行酶切、PCR鑒定。將構建好的基因敲除載體轉化組成型表達Cre重組酶的大腸桿菌BM25.8,驗證Loxp位點的活性。結果表明,構建了奶山羊BLG基因第2外顯子缺失的基因敲除載體pBLG2T,且pBLG2T載體中的正選neo基因可以被Cre重組酶去除。為獲得BLG 1條等位基因缺失型細胞株以及培育高產(chǎn)優(yōu)質奶山羊新品種奠定基礎。

豬源鏈球菌對大環(huán)內酯類主要耐藥基因的檢測/芮萍（河北科技師范學院河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 秦皇島 066004），馬增軍，陳翠珍…//中國獸醫(yī)學報.-2011，31(6).-838～842

為了解豬源鏈球菌對紅霉素相關耐藥基因ermB、ermA和mefA的分布,對河北省及遼寧部分地區(qū)的64株豬源鏈球菌分離株,用PCR方法檢測51株紅霉素耐藥株和13株紅霉素敏感株中ermB、ermA和mefA基因。結果顯示,耐藥菌株中ermB基因的檢出率為98.04%(50/51),ermA的檢出率為25.49%(13/51),沒有檢出mefA基因。初步表明河北省及遼寧部分地區(qū)的豬源鏈球菌對紅霉素的耐藥機制以ermB基因介導為主。20株菌的ermB基因核苷酸序列與GenBank中同源序列相似性為99%～100%。與參照序列AJ972604.1相比,20株菌的ermB氨基酸序列的突變位點較少,主要有Thr 75→Ser、Ser 100→Asn、Arg 118→His、Leu 175→Ile,以100和118位突變?yōu)橹?進一步說明ermB基因是相對穩(wěn)定的。

利用反向遺傳技術拯救H9N2重組病毒/井波（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001），李呈軍，陳化蘭//中國獸醫(yī)學報.-2011，31(6).-835～837，851

為研制高效特異的H9N2亞型AI疫苗,選取我國具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(簡稱SH10),以12質粒系統(tǒng)為基礎,利用反向遺傳操作技術構建了1株表面基因由SH10提供、內部基因由12質粒系統(tǒng)提供的重組病毒SH/PR8,為新型疫苗的研制提供了新的毒株。

FSH對體外培養(yǎng)仔豬睪丸支持細胞skp2表達的影響/甘瑞（西南大學動物科技學院重慶市牧草與草食家畜重點實驗室 重慶 400716），左敬，張國升…//畜牧獸醫(yī)學報.-2011，42(6).-765～771

本研究旨在確定促卵泡素是否可通過cAMP、Ca2+內流和細胞外調節(jié)的蛋白激酶(ERK1/2)調節(jié)培養(yǎng)條件下未成熟仔豬睪丸支持細胞中S期激酶相關蛋白2(skp2)的表達。以培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞為實驗材料,通過添加各種信號通路的抑制劑,運用Western blot檢測skp2、p27kip1蛋白的表達,運用實時熒光定量PCR檢測skp2mRNA的表達。結果發(fā)現(xiàn),促卵泡素(50ng.mL-1)以時間依賴的方式促進了skp2蛋白和mRNA的表達(P＜0.05),這一作用在30min時達到高峰。FSH(50ng.mL-1)和Forskolin(10μmol.L-1)均促進了skp2蛋白和mRNA的表達(P＜0.05),但降低了p27kip1蛋白的水平,而Rp-cAMP、Verapamil和U0126都抑制了FSH的作用,使skp2蛋白和mRNA的表達有所下降,但提高了p27kip1蛋白的表達,但3種抑制劑單獨作用時對skp2蛋白、mR-NA以及p27kip1蛋白的表達沒有顯著影響(P＞0.05)。這表明FSH可能主要通過影響cAMP的產(chǎn)生和Ca2+內流,并激活ERK1/2通路調節(jié)skp2蛋白的表達,而skp2蛋白的水平與p27kip1蛋白成負相關。

豬SelS基因啟動子區(qū)的克隆及序列分析/張寧波（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193），井文倩，李奎//畜牧獸醫(yī)學報.-2011，42(6).-759～764

本研究旨在克隆和分析豬硒蛋白S基因(Selenoprotein S,SelS)啟動子序列,并初步探討潛在轉錄因子結合位點對其表達的影響。通過SON-PCR技術克隆豬SelS基因啟動子序列,利用PromoterScan、Promoter 2.0等在線工具預測其啟動子特征,利用細菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激PK15細胞,研究NF-kappaB轉錄因子對豬SelS基因啟動子活性的影響。試驗獲得了豬SelS基因約3kb的啟動子序列,部分序列比對發(fā)現(xiàn)豬、人、牛和小鼠物種間相似性僅7%～51%。預測豬SelS基因轉錄起始位點在-398bp,豬和人SelS基因啟動子存在系列保守的轉錄因子結合位點,包括NF-kappaB、CCAAT box、SP1、USF等,但均未發(fā)現(xiàn)典型的TATA box。細胞試驗表明,NF-kappaB轉錄因子可以上調豬SelS基因的表達。結果提示,物種間SelS基因啟動子相似性較低,但豬和人SelS基因的轉錄因子非常保守,LPS誘導試驗提示,豬SelS基因表達可能受NF-kappaB轉錄因子的調控。

雞恒定鏈分子跨膜區(qū)2個氨基酸殘基在形成MHCⅡ-Ii復合物中的作用/許發(fā)芝（安徽農(nóng)業(yè)大學安徽省人獸共患病學重點實驗室，合肥23003），吳勝國，劉雪蘭…//畜牧獸醫(yī)學報.-2011，42(5).-721～728

本研究旨在探明雞恒定鏈跨膜區(qū)特定氨基酸在形成MHCⅡ-Ii復合物聚合中的作用特征。用大引物PCR定點突變法將雞Ii鏈跨膜區(qū)2個氨基酸Gln47和Thr50分別突變?yōu)楸彼?Ala),再連接到pEGFP-C1載體中,構建含Ii-GFP融合基因的真核表達載體。同時還分別構建了含pDsRed2-N1-MHCⅡα、pDsRed2-N1-MHCⅡβ、pEGFP-N1-MHCⅡα和pEGFP-N1-MHCⅡβ真核表達載體。用脂質體介導法將這些重組質粒單獨或共轉染至COS-7細胞,培養(yǎng)48h后經(jīng)熒光顯微鏡檢測野生型Ii和突變型Ii與MHCⅡ類分子的細胞定位,并通過免疫共沉淀研究它們之間的相互關系。結果顯示,野生型Ii鏈與MHCⅡα或MHCⅡβ之間存在細胞內的共定位,而突變型Ii與MHCⅡα或MHCⅡβ在細胞中共表達后未出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀結果顯示,在野生型Ii鏈與MHCⅡα或(和)MHCⅡβ單轉染或三者共轉染COS-7細胞后,均能檢測到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii復合物,而突變型Ii鏈與MHCⅡα或(和)MHCⅡβ單轉染或三者共轉染COS-7細胞后,均檢測不到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii復合物。因此Ii鏈跨膜區(qū)Gln47和Thr50 2個氨基酸對于MHCⅡ-Ii復合體的形成是至關重要的。

3種受體抑制劑對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細胞的影響/尹鑫（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 哈爾濱 150030），張穎，劉瀾瀾…//畜牧獸醫(yī)學報.-2011，42(5).-704～710

本研究旨在闡明雞氨肽酶N(chAPN)、唾液酸以及硫酸乙酰肝素在傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41株感染宿主細胞中的作用以及3種受體特異抑制劑對IBV M41株在自然宿主CEK細胞內增殖能力的影響。作者選擇苯丁抑制素(Bestatin)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和肝素酶Ⅲ分別作為APN、唾液酸以及硫酸乙酰肝素的抑制劑,在不同條件下,單獨或共同預處理CEK細胞,而后接入IBV M41株病毒感染細胞,應用熒光定量PCR方法定量檢測IBVM41株在CEK細胞中的增殖變化,應用雞胚半數(shù)感染劑量法(EID50)測定病毒感染雞胚能力的變化。結果表明,經(jīng)Bestatin和NA處理的CEK細胞獲得了抵抗IBV M41株感染的能力,與未經(jīng)處理的(對照組)細胞相比,Besta-tin和NA能顯著降低IBV M41株在CEK細胞內的增殖及對雞胚的感染能力(P＜0.01),且Bestatin處理后CEK細胞內的病毒增殖量顯著低于NA處理后CEK細胞內的病毒增殖量,兩者病毒液的EID50滴定值差異顯著(P＜0.01);肝素酶Ⅲ的處理則對病毒增殖無顯著影響;3種受體抑制劑共同處理CEK細胞后,病毒增殖量顯著下降(P＜0.01),但仍有病毒增殖,病毒液的EID50滴定值為102.12±0.05.0.1mL-1。結果提示,chAPN在IBV感染宿主細胞的過程中發(fā)揮特異性受體作用,而唾液酸在IBV感染宿主細胞中發(fā)揮輔助受體作用,硫酸乙酰肝素不是IBV在自然感染中的必需因素,同時提示,可能存在其他未知受體因子參與IBV感染宿主細胞的過程。

不同采集方法對豬卵母細胞的采集效率和成熟率的影響/卿玉波（云南農(nóng)業(yè)大學 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201），魏紅江，姜河?！?/畜牧獸醫(yī)學報.-2011，42(5).-629～634

本研究旨在開發(fā)出一種對COCs損傷小且采集效率和卵母細胞成熟率高的卵母細胞采集方法。從屠宰場采集來的卵巢運回實驗室后隨機分為3組,分別用抽吸法、解剖法和刀切過濾法3種方法采集COCs,然后進行體外成熟培養(yǎng),通過對COCs采集效率、COCs完整性及卵母細胞體外成熟率的比較,研究解剖法、刀切過濾法和抽吸法3種采集方法對豬卵母細胞的采集效率和成熟率的影響。結果表明：每個卵巢采集COCs個數(shù),刀切過濾法顯著高于解剖法和抽吸法(P＜0.05),而解剖法僅為1.55個,顯著低于抽吸法(P＜0.05);采集效率抽吸法最佳,采集和挑選單個COCs的時間顯著低于解剖法和刀切過濾法(P＜0.05),刀切過濾法次之,但顯著低于解剖法(P＜0.05);A、B級COCs比例,解剖法高達99.23%,顯著高于其他2種方法(P＜0.05),刀切過濾法與抽吸法差異不顯著(P＞0.05);卵母細胞的成熟率,解剖法和刀切過濾法都達到80%,二者間差異不顯著(P＞0.05),但顯著高于抽吸法(P＜0.05);100個成熟卵母細胞所需的卵巢數(shù)量,刀切過濾法最少,僅為17.4個,而解剖法和抽吸法分別高達80.6和90.3個;需要的總采集時間(采集和挑選的時間),刀切過濾法最低,僅為126.6min,而解剖法最高,為758.9min。綜上所述,與抽吸法和解剖法相比,刀切過濾法是一種高效、快速的卵母細胞采集方法。