涂片染色法在精液白細胞檢驗中的應用

馬曉慧 車小新*

（1 河南省人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003；2 河南省人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450003）

人精液中白細胞計數(shù)的傳統(tǒng)方法是用組織化學方法鑒定多形核粒細胞特有的過氧化物酶，雖然這種技術有相對易于操作的長處，但它不能檢測已經(jīng)活化并已釋放其顆粒的多形核白細胞，也不能檢測不含過氧化物酶的其他種類的白細胞[1]。例如淋巴細胞。這類細胞通過免疫細胞化學方法進行檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組患者選自筆者所在醫(yī)院門診及住院患者50例，30～35歲9例，36歲～40歲29例，41歲-45例12例。實驗室進行精液常規(guī)檢查的患者。在直接涂片檢驗，高倍鏡下判定為“白細胞”，其數(shù)量＜10/HP，精子精量＜50×109/L的對其同時進行涂片染色檢驗。

1.2 方法

正甲苯胺過氧化物酶染色：試劑應用飽和NH4CI溶液（ 250g/L），50g/L Na2EDTA磷酸緩沖液（pH 6.0），正甲苯胺（0.25mg/mL），30%H2O2蒸餾水溶液。此工作液含：1mL試劑1；lmL試劑2；9mL 試劑3；和一滴試劑此溶液配制后可使用24小時。試驗步驟將0.lmL精液與0.9mL工作液混合，振蕩2分鐘，在室溫下放置20～30min，再振蕩，過氧化物酶陽性細胞被染成棕色，而過氧化物酶隴性細胞不著色，用白細胞計數(shù)池重復計數(shù)200個白細胞兩次，并估計過氧化物酶陽性和陰性細胞的百分比。

2 結 果

共檢驗出疑似“白細胞”標本50份，采用正甲苯胺過氧化物酶染色檢查后，僅發(fā)現(xiàn)10份標本系白細胞。其中5份僅檢出白細胞，5份標本同時還檢出各級生精細胞，其數(shù)量各約占50%。有18份標本只發(fā)現(xiàn)個別白細胞，絕大部分細胞系為各級生精細胞。余22份標本只發(fā)現(xiàn)各級精母細胞而未發(fā)現(xiàn)白細胞。

3 討 論

精子中最主要的結構為一濃集的細胞核，攜帶遺傳物質即DNA，成熟的精子中胞漿少，既無核RNA又無漿RNA。既不生長，也不分裂僅含單倍體量的DNA。從一個雙倍體精原細胞發(fā)育為近百個單倍體精子需增加幾十倍的DNA。用放射自顯影術證明這些DNA均在精子細胞有絲分裂過程中合成，細線期初級精母細胞后不再有DNA合成。初級精母細胞中含四倍量DNA，經(jīng)兩次成熟分裂到精子細胞期即成為單倍體細胞。也曾用放射自顯影術研究RNA代謝，精原細胞和精母細胞均有RNA代謝，精子細胞早期有低水平RNA合成，中期精子細胞后就不再合成[2]。精原細胞和精母細胞均可合成核仁RNA及非核仁RNA。細線期與偶線期精母細胞中核仁RNA合成達高峰值，而非核仁RNA合成高峰在粗線期精母細胞。

試驗發(fā)現(xiàn)葡萄搪對精子發(fā)生過程中的蛋白質合成系統(tǒng)有保護作用。體外的氨基酸摻入試驗證明，加入葡萄糖后各級生精細胞中氨基酸摻入均增加。粗線期初級精母細胞的摻入量最多，早期精子細胞摻入量增加的幅度最大。葡萄糖還能大大減輕溫度對睪丸蛋白質合成的破壞作用。目前來看，葡萄糖供應對精子細胞的變態(tài)過程及其蛋白質合成系統(tǒng)十分重要，而精原細胞及初級精母細胞的蛋白質合成對葡萄糖的依賴就不強。故FSH起一始動作用，發(fā)動以后單獨靠睪酮也可維持一定生精功能。三種激素均不能直接作用于生精細胞，都直接或間接作用于支持細胞，然后進一步創(chuàng)造適合精子發(fā)生的內(nèi)環(huán)境。已在支持細胞表面證實有FSH受體，F(xiàn)SH并不能通過血睪屏障;在支持細胞內(nèi)也證實有雄激素受體[3]。雄激素也可作用于曲細精管壁周圍的類肌細胞。大多數(shù)學者認為ICSH主要促進間質細胞分泌雄激素，然后刺激精子發(fā)生，這些均提示支持細胞在精子發(fā)生的調控中占特殊地位。又發(fā)現(xiàn)支持細胞還可調節(jié)間質細胞合成與分泌睪丸酮。體外培養(yǎng)的支持細胞可分泌一種促進間質細胞分泌睪丸酮的因子，同時支持細胞可分泌雌激素及LHRH樣物質，這兩個激素卻是間質細胞功能的抑制因子。支持細胞與間質細胞間也有復雜的功能關系。

睪網(wǎng)液內(nèi)的精子有活動能力，一旦進入附睪頭段后即失活力。精子在附睪運行過程中運動方式有規(guī)則性的改變，先出現(xiàn)原地擺動，然后轉圈狀運動，最后才有螺旋式的向前運動。所以觀察精子的運動方式是衡量精子成熟的一個指標。精子成熟過程中細胞內(nèi)cAMP增加與精子動力獲得密切相關。使用磷酸二酯酶可使未成熟精子內(nèi)cAMP含量升高并產(chǎn)生一定運動能力，但并無前向運動。研究證實附睪頭部磷酸二酯酶的活性為附睪尾的兩倍，這可能是精子成熟過程中cAMP升高的原因。附睪上皮還可產(chǎn)生一特異的前向運動蛋白，這種糖蛋白與附睪精子結合時可促進其產(chǎn)生前向運動[4]。另外Ca2+也是調節(jié)精子運動的重要因素。

精子發(fā)生過程中，其核中發(fā)生組蛋白型的轉變。精子在附睪內(nèi)運行過程中精子核中DNA與魚精蛋白緊密結合，故表現(xiàn)為精子成熟過程中精子核的DNA細胞化學染色（如Fculgen）不斷減弱，這也是精子是否成熟的重要指標。精子成熟過程中最重要的結構改變是蛋白質結合硫基減少，而二硫鍵增加。這種改變可見于精子核、頂體下區(qū)、頂體后區(qū)、精子中段、鞭毛纖維鞘、精子膜。如此廣泛的轉換與精子結構的穩(wěn)定密切相關。

精子成熟過程中磷脂、脂肪酸及硫基等的改變均意味膜結構的改變。附睪分泌一些物質附著精子表面使精子結構與性質明顯改變。精子膜在受精過程中起關鍵作用，這表明精子成熟過程中其膜結構已成熟到能完成受精作用的地步；但另一方面附睪精子要在射出以后轉運到輸卵管時才真正發(fā)生受精作用，故附睪精子膜在成熟的同時還將覆蓋上一些物質使之暫時不起作用。總之精子成熟過程中膜有兩方面改變，一是為受精做好準備，另一是暫時阻抑其受精功能。精子在陰道內(nèi)不會獲能，若宮頸口開放則可使精子獲能。子宮是精子獲能的主要場所，輸卵管分泌液卵泡液及卵丘也參與獲能，精子只有與子宮內(nèi)膜接觸才能獲能。分析家兔子宮及輸卵管中的淀粉酶均高于血清水平幾倍，淀粉酶也隨性周期改變，以排卵期最高。另精子在宮腔內(nèi)有大量白細胞出現(xiàn)，白細胞一進人宮腔，精子即與其附著，白細胞中的糖原分解成葡萄糖供精子能量需要，另自細胞特殊顆粒釋放水解酶以去除精子表面的去能因子未完成獲能的第一步反應。

卵母細胞外有一層糖蛋白構成的透明帶，透明帶外是富含粘多糖的卵丘與放射冠，精子要同時消化粘多糖和蛋白質才能與卵結合。頂體酶系中有一些特殊的酶，透明質酸酶可消化卵丘細胞，放射冠分散酶可使放射冠解體，頂體蛋白酶使精子穿過透明帶。透明質酸酶最適pH是3.8，此酶的活性有賴于鈉、鉀濃度，hCG誘發(fā)排卵后的子宮液能促進其釋放，孕酮及切除卵巢后的子宮液則抑制其活性。放射冠分散酶是一脂糖蛋白，只作用于放射冠不影響透明帶。頂體蛋白酶是一大類蛋白酶，可使透明帶分解，又稱為類胰蛋白酶。人精子中頂體蛋白酶可被宮頸粘液中的抗胰蛋白酶抑制劑及抗凝血酶所抑制，此三種物質在排卵期的宮頸粘液中均減少。頂體蛋白酶具氨基肽酶、酯酶及蛋白酶活性，對精氨酸鍵有高度選擇作用。頂體中還有唾液酸酶，是與頂體結合最緊的酶。一般認為它可改變透明帶的結構，不讓其他精子再穿過。

[1]黨小軍,胡淑玲,李芒會.流式細胞術在白細胞精子癥精子質量評估中的應用[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2011,26(3):45-46.

[2]李如凱,郭龍華.C14orf48基因在人精液精子中的表達和生物信息學分析[J].中國實驗診斷學,2011,15(6):23-24.

[3]李雪蘭,鐘曉敏.尿液中含有精子對檢測結果的影響[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2011,13(6):65-66.

[4]黎興盛,鮑琳,楊春,等.216例男性不育癥精液檢驗與血清中抗精子抗體的關系[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(2):99-100.