蚊蟲胃血血源鑒定方法

郭紹華，周水森

媒介控制是蚊媒傳染病防治的主要措施之一，有效的媒介控制依賴于準確的媒介調查，其中吸血習性調查是媒介調查的重要內容。尤其自Macdonald 1957年提出瘧疾流行病學數(shù)學模型后，吸血習性已成為決定按蚊傳播瘧疾能量大小的一個重要參數(shù)[1]。通過鑒定蚊蟲胃血來源于某種或某個動物（人），可以計算蚊蟲的叮人率、人血指數(shù)等傳播動力學的主要參數(shù)，此外，確定了蚊蟲胃血來源還有助于了解蚊媒傳染病可能的動物保蟲宿主范圍。本文簡要介紹蚊胃血傳統(tǒng)血清學鑒定方法，并依據國內外相關研究進展重點綜述近年基于DNA的分子鑒定方法，為媒介調查工作提供參考。

1 血清免疫學方法

1.1 沉淀試驗 蚊胃血血源鑒定最常用的血清學方法是沉淀試驗（precipitin test），其原理是少量濃度較高的特異性抗體與可溶性抗原互相反應生成抗原抗體復合物，并凝集產生肉眼可見的沉淀物。1923年，Bull[2]最早將沉淀試驗引入蚊腹血源的鑒定，幾經改進，沉淀試驗在蚊蟲血源鑒定方面發(fā)揮了巨大作用。

蚊蟲吸血習性沉淀試驗主要包括如下5種方法：環(huán)狀沉淀試驗、毛細管沉淀試驗、瓊脂擴散試驗、微孔板法和凝膠表面沉淀試驗。最簡單也是最常用的是環(huán)狀沉淀試驗，因所需設備少，操作簡單、結果易于判讀而得到了廣泛應用。環(huán)狀沉淀試驗僅需細長小玻璃管，血清放置在試管底部，待檢血樣輕輕加入管中，兩液體交界處出現(xiàn)乳白色環(huán)者為陽性反應。另一種較為常用的是毛細管沉淀試驗，其原理與環(huán)狀沉淀試驗相似，只是將細玻璃管換成毛細管[3]，交界面出現(xiàn)渾濁表示陽性反應。另外，毛細管沉淀反應在試劑的制備和抗血清的篩選上也進行了一些改進，以提高特異度和靈敏度。這2種方法在大多數(shù)調查中仍在使用。其他3種沉淀試驗也用于鑒定蚊腹血源。瓊脂擴散試驗[4]原理是可溶性抗原和抗體在含有電解質的瓊脂凝膠板的對應孔中各自向四周凝膠中擴散，當二者相對應時，即發(fā)生特異性反應，在濃度比例合適處形成可見的白色沉淀線。該法簡單易操作，并能將結果永久記錄，但沉淀線的特征與擴散速度、抗原抗體濃度、純度等多種參數(shù)有關，判讀相對繁瑣，且其敏感性不如前兩種。

微孔板法理論上也是鑒定血源可行的方法，但其應用較為局限，僅見少量文獻報道。Tesh[5]稱微孔板法鑒定蚊蟲腹血來源比毛細管沉淀技術結果更易判讀，但需血量大，而蚊蟲胃血量有限，故也未在蚊蟲胃血鑒定中廣泛應用。凝膠表面沉淀試驗[6]是將抗血清與瓊脂混合，放在玻片上，將待檢血樣滴加到玻片上（1～3μL），其靈敏度與其他沉淀方法相似。雖然這種方法可能快速檢測血源，但從未用于現(xiàn)場標本的檢測。

沉淀試驗盡管操作簡便，但其敏感性和特異性均不高，少量血漿蛋白通過沉淀試驗難以檢出。此外，檢測多重血源特異性較低[7]。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）技術，不僅具有高度的敏感性和特異性，而且酶與抗體（或抗原）結合穩(wěn)定、安全，操作簡單，結果判斷可用肉眼觀察或分光光度計檢測等優(yōu)點，而且適于現(xiàn)場大規(guī)模應用，早已應用于各種疾病免疫學診斷和流行病學篩查[8]。胃血鑒定中用到了兩種基本的ELISA法：直接ELISA（direct ELISA）和間接 ELISA（indirect ELISA）。間接ELISA，即夾心法，將宿主特異性抗血清加入96孔微量滴定板孵育，用與待測胃血樣本同源的免疫球蛋白包被板上的抗－IgG，洗滌，去除非抗原成分，用宿主特異性抗體酶結合物來檢測特異性反應。直接ELISA用宿主特異性抗體－酶結合物來檢測胃血樣本中同源的IgG。兩種方法的主要不同在于間接ELISA用抗血清捕捉胃血中的宿主特異性IgG，而直接ELISA用抗體酶結合物結合特異性IgG。采用何種ELISA方法取決于研究目的。Edrissian[9]等用直接ELISA篩查蚊胃血中人血的數(shù)量，對伊朗5 000只按蚊進行了人血檢測，有經驗的技術員可以每周檢測1 000只按蚊胃血。Burkot[10]采用間接ELISA法鑒定蚊吸血宿主的種類，在威斯康辛州鑒定出蚊吸食含野生動物在內的16種宿主。間接ELISA技術上比較難，因為必須提前制備各種待檢宿主的抗血清。在已知宿主種類范圍的前提下間接ELISA較為適用。直接ELISA較適用于調查蚊蟲的吸人血狀況，目前除了人的抗體－酶結合物可以商業(yè)獲得外，常見家畜的抗體－酶結合物也可以獲得，所以直接ELISA可擴展用于人和 家 畜 血 鑒 定[11]。Chow[12]提 高 了 抗 體 夾 心ELISA的靈敏度，但是因為商業(yè)能獲取到的抗體酶結合物的種類有限，所以ELISA檢測的宿主種類有限。ELISA法彌補了沉淀實驗敏感性和特異性較低的局限[13]，但該方法需要前期沉淀試驗篩選抗動物的IgG酶結合物，且待檢樣品要求新鮮血液，這些條件限制了其應用前景。

1.3 被動血凝抑制試驗 被動血凝抑制試驗（passive hemagglutination inhibition technique，PHI）用于蚊胃血源的鑒定[14－15]可區(qū)分近緣宿主。技術原理是未知抗原與已知抗體相結合，并添加紅細胞（羊或兔）特異性抗原作指示物。如未知抗原與抗體結合，則紅細胞不凝集，產生陽性反應；若未知抗原不與抗體結合，則抗體將與紅細胞結合，產生凝集，為陰性反應。與沉淀試驗相比，盡管PHI的方法有極高的靈敏度（范圍在8～10g蛋白質）和特異性，但它因操作復雜，應用并不廣泛[16]。

傳統(tǒng)血清學方法需提前制備各種潛在宿主動物的免疫血清，并需消除雜交反應，步驟較為繁瑣，且敏感性和特異性均不高[17]，僅能鑒定到不同物種間的血源，難以區(qū)分親緣種或同物種不同個體。

2 分子鑒定方法

分子鑒定方法通過分析血源基因來實現(xiàn)蚊蟲胃血來源的鑒定。各種分子鑒定技術因其具有較高的可靠性、特異性和快速、靈敏的特點，可以準確鑒定蚊胃血源到種和個體，胃血血源分析用到的基因有線粒體基因（細胞色素b、細胞色素氧化酶I）、編碼核糖體RNA基因和核基因[18]。常用于蚊胃血源鑒定的分子方法有：DNA測序、多重PCR、限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCR－RFLP）、實時熒光定量PCR （real－time PCR）、異源雙鏈分析、斑點雜交和DNA指紋法。

2.1 DNA測序（DNA sequencing） 采用保守引物擴增各種可能吸血對象的同源性DNA片段以鑒定蚊蟲吸血對象。DNA條形碼技術（DNA barcod－ing method）正是利用了DNA序列信息。DNA條形碼技術簡單地說，就是通過使用一個或一些短的DNA基因片段作為條形碼來對物種進行快速、準確識別的技術。Miguel[19]采用DNA條形碼技術鑒定蚊腹血，充分利用生物條碼系統(tǒng)（Barcode of Life Datasystem，BOLD）的公共網絡COI基因信息庫獲取蚊蟲可能吸血對象及蚊蟲的同源性DNA序列，設計吸血對象保守引物，只擴增吸食的脊椎動物COI基因片段，而不擴增蚊蟲自身COI基因片段，獲得腹血擴增DNA序列后，將該序列網絡查找相應數(shù)據庫的匹配序列，如GenBank或Barcode of Life Datasystem，從而判定出胃血來源。如果數(shù)據庫中沒有完全匹配的序列，則依據排名靠前的序列將該序列逐步歸于相應的門、目、科、屬。線粒體基因因拷貝量大，且種間變異大，故在微量蚊胃血血源鑒定中廣泛應用。DNA擴增測序另一常用到的片段為線粒體Cytb[20]。對于cytb，種內允許存在不大于1%或2%的序列變異[21]；同樣，對于COI，根據Kimura兩參數(shù)計算序列變異顯示種間變異0.25%，屬間變異6.8%，科間變異10%～12%[22]。因此，只要序列匹配高于98%～99%就可以進行腹血源的種間鑒定。DNA測序法直觀、準確，但費用較高，不適用于大量樣本檢測。

2.2 多重PCR（multiplex PCR） 當已知可能吸血宿主種類范圍，或僅需將吸血對象進行粗略分類時，可以采用多重PCR方法。該方法是根據調查地區(qū)常見蚊蟲吸血對象的同源性基因序列差異，設計種特異性引物，通過PCR擴增，獲取大小不同的片段，與預期片段大小比較，判定血源。Kent ＆Norris[23]在非洲根據研究村子按蚊常見吸血對象（人、牛、羊、豬和犬）的線粒體DNA－cytb序列差異設計種特異性引物，以保守的反向引物和動物特異性引物采用多重PCR擴增不同動物種特異片段，在凝膠電泳上依據條帶大小直觀判斷蚊胃血來源。該法簡單易行，適用于具體地區(qū)現(xiàn)場蚊蟲吸血習性調查[24－25]。多重PCR鑒別關鍵在于引物的設計與選擇，特異性引物要求能準確區(qū)分不同物種，保守引物在使用前需要對各類脊椎動物進行預檢測，以防交叉反應。

2.3 限制性片段長度多態(tài)性PCR 當直接測序法太貴或無法測序、特異性PCR引物無法擴增出預期的特異性條帶或種間的基本序列差異不足以設計可靠的種特異性引物時，可以采用限制性片段長度多態(tài)性 PCR（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法來鑒定蚊胃血源。Ngo[26]根據當?shù)爻Ｒ婙B類的cytb設計簡并引物擴增同源的DNA片段，然后將擴增片段用Hae III和Dde I限制性內切酶酶切產生特異性條帶來鑒定蚊胃血源鳥類宿主。T－RFLP（末端限制性片段長度多態(tài)性）由RFLP發(fā)展而來，與RFLP不同之處在于每條引物末端進行熒光染料標記。2005年Meece[27]采用TRFLP法對蚊蟲胃血69種脊椎動物中的67種進行種間鑒定，采用保守引物擴增特異片段（如cytb片段），在每條引物末端進行熒光染料標記，PCR擴增產物被AciI，AluI，HaeIII和RsaI 4種限制性內切酶消化，毛細管電泳呈現(xiàn)8種不同大小和顏色的DNA片段，然后通過查詢網絡數(shù)據庫來分析TRFLP圖譜。缺點是該方法需要克隆基因作探針，工作量較大，且DNA用量和純度都要求較高。

2.4 實時熒光定量PCR 在腹血DNA量少且部分消化的情況下，實時熒光定量PCR（real－time PCR）技術在胃血鑒定方面比傳統(tǒng)PCR效率明顯提高[28]。該技術的基本原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號輸出實時監(jiān)測整個PCR過程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析[29]。采用基于cytb的358bp片段的real time TaqMan PCR方法鑒定吸食土著澳大利亞哺乳動物的蚊蟲的腹血，檢測靈敏。該法也用于跳蚤腹血的常見8種吸血宿主的鑒定[30]，該法檢測靈敏度和特異度均高，能夠檢出1pg的胃血DNA。

實時熒光定量PCR特異性和敏感性高、結果客觀準確、無需后續(xù)電泳檢測是該技術的優(yōu)點，但探針標記成本較高且需要較強的專業(yè)知識，實時PCR儀價格昂貴，儀器操作也需要專業(yè)培訓，這些條件限制了其現(xiàn)場應用。

2.5 異源雙鏈分析 異源雙鏈分析（Heteroduplex analysis，HA）是基于DNA鏈變性和退火形成同源和異源雙鏈DNA分子，在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，同源雙鏈和異源雙鏈的泳動性不同。該技術在生物醫(yī)學領域用來檢測人基因中引起疾病的突變[31]。

在蚊蟲胃血鑒定中采用來源于同種或親緣關系很近的物種單倍體cytb基因作為檢測基因，與每個待檢樣本混合，PCR反應，產生同源雙鏈和異源雙鏈DNA分子，因此異源雙鏈由兩種不同脊椎動物物種的退火PCR產物組成[32]。因此，只要具備已知來源DNA、脊椎動物種特異性引物和一個或多個核苷酸差異，該方法可將蚊胃血血源鑒定到種一級[33－35]。該技術結果可重復性強，但是操作技術要求高，不易掌握。

2.6 斑點雜交 斑點雜交（dot blot）是指將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜，NC膜）上，用已標記的探針進行雜交，洗膜（除去未接合的探針），放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。

生物素標記的探針區(qū)分人、狗、牛、豬、鼠和山羊的DNA，提取將以上人和動物的DNA高溫變性后點加在硝酸纖維素膜上，用放射性探針進行雜交，根據雜交反應和強度來區(qū)分不同的吸血對象來源，但該方法在人和日本獼猴間出現(xiàn)交叉反應[36]，另外，生物素標記因具備放射性，限制了其在現(xiàn)場中的應用；Koella.[37]等進行了改進，采用非同素探針代替放射性生物素探針，改進后的方法同樣可以區(qū)分不同吸血來源宿主，檢測發(fā)現(xiàn)同域分布的An.Quadrimaculatus A比B和C1更傾向于吸食人血。

2.7 DNA指紋法 上述血源鑒定方法均不能鑒定到種群內的不同個體?；谖⑿l(wèi)星技術的DNA圖譜法，也稱DNA指紋法（DNA finger print）已被用來區(qū)分不同個體脊椎動物宿主獨特的基因型。

微衛(wèi)星標記（microsatellite）或短串聯(lián)重復序列（STR）存在于大多數(shù)真核生物的基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復片段構成，由于重復單位的重復次數(shù)在個體間呈高度變異性并且數(shù)量豐富，因此微衛(wèi)星標記的應用非常廣泛。通過擴增和比對從蚊蟲和其相應宿主血液中提取的基因組DNA微衛(wèi)星序列，待測圖譜與可能吸血的相應宿主個體的圖譜進行比較、匹配，不僅為蚊蟲的宿主選擇性研究提供依據，也為個體患蚊媒病的風險評估提供了依據。為產生重復性指紋，需要從胃血中提取足量完整高分子量的DNA和能區(qū)分宿主的高辨識度的分子標記。

Coulson[38]和Gokool[39]采用擴增蚊腹中的人血重復DNA序列片段來尋找宿主個體，成功獲取鑒定性微衛(wèi)星序列，對應吸血的對象。Chow－Shaffer[40]將人高度多態(tài)的STR位點引入鑒定，銀染丙烯酰胺變性凝膠，放射自顯影觀察條帶，然后比對蚊胃血DNA和人頰部刮取樣本DNA。Scott[41]采用DNA指紋法鑒定肯尼亞傳瘧媒介的腹血，該方法大大促進了對蚊蟲對不同人個體、不同年齡組嗜血習性的流行病學研究。

盡管目前所有的工作都圍繞銀染或放射標記凝膠顯示微衛(wèi)星等位基因大小，該技術也可采用熒光標記引物自動化操作，使用軟件包獲取微衛(wèi)星基因型和等位基因大小。

3 展 望

目前傳統(tǒng)血清學方法鑒定蚊胃血源仍在使用，但需提前制備各種潛在宿主動物的免疫血清，并需消除雜交反應，步驟較為繁瑣，且敏感性和特異性均不高，已難以滿足精確鑒定蚊胃血源的需求?；诨虻姆肿由飳W鑒定方法已被證實非常有效，分子生物學鑒定蚊胃血血源依賴于準確的DNA序列，隨著基因序列庫的日趨完善，該法顯示出巨大的優(yōu)勢，已逐步應用于現(xiàn)場檢測，有可能迅速取代傳統(tǒng)血清學方法成為鑒定蚊蟲胃血血源的常規(guī)方法。

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