玉米秸稈處理方法對其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

張萬忠， 杜金峰，， 王 闖， 王云山， 蘇志國

(1.沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽110142;

2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190)

乙醇是一種重要的工業(yè)原料，具有安全、清潔、可再生等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，且可部分或全部替代汽油.目前，利用玉米秸稈發(fā)酵乙醇已在一定程度上減少人類對化石能源的依賴，但在預(yù)處理和酶解過程中常伴隨有乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等抑制物生成，這些抑制物可以抑制菌體對糖的消耗，降低其生長代謝水平［1］.

乙醇發(fā)酵過程中水解副產(chǎn)物的抑制問題一直是阻礙纖維素乙醇發(fā)酵的主要因素之一［2］.近年，對有機酸和糠醛類抑制微生物發(fā)酵的研究主要集中在兩個方面:一是研究有毒物質(zhì)的抑制機理，并對菌種改造或改良;二是發(fā)酵液的脫毒處理，通過物理或化學(xué)的方法，用石灰乳中和［3］、活性炭吸附［4］、真空濃縮［5］和離子交換［6］等多種脫毒方法消除或降低抑制因子的影響，從而有利于發(fā)酵的高效進行，獲得高產(chǎn)率的燃料乙醇.

本實驗采用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，考察玉米秸稈在酶解過程中水洗、滅菌與碳源加入方式對乙醇發(fā)酵的影響，初步確定酶解過程中抑制物的來源，以期為玉米秸稈乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供借鑒，提高乙醇得率.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米秸稈:產(chǎn)自北京郊區(qū)，自然風(fēng)干的玉米秸稈切成3～4 m長段，放入超細粉碎機中粉碎，粉碎后為100～200目秸稈粉.

纖維素酶:寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司出品，濾紙酶活為83 IU/mL，酶活定義為國際單位(IU)［7］，即1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1酶活單位.

高溫釀酒干酵母(Saccharomyces cerevisiae):安琪酵母股份有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

TS-2102新型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海天呈實驗儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;Anke TGL-16C臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;XZ-7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中科院生物物理所科龍儀器廠;SBA-40 E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所;Ag-ilent 4890氣相色譜儀.

1.3 酶解

稱取處理后的干燥秸稈粉，按照一定的固液比置于250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)底物混合物的pH值為4.8，每克纖維素加入纖維素酶30 IU，在轉(zhuǎn)速為100 r/min、溫度為55℃搖床中振蕩水解48 h，測定葡萄糖含量.

1.4 乙醇發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米秸稈水解液1 L(玉米秸稈酶解液于4 000 r·min－1離心15 min，取上清液)，加入(NH4)2SO41 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，pH為5.5.將玉米秸稈水解液配成發(fā)酵培養(yǎng)基，于115℃滅菌20 min，冷卻后接入兩環(huán)活化的安琪耐高溫釀酒酵母，放置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取樣測定乙醇含量.

乙醇得率按下式計算:

m0和m1分別為葡萄糖質(zhì)量(g)和乙醇質(zhì)量(g).

1.5 檢測方法

葡萄糖的測定采用SBA-40E生物傳感分析儀.

乙醇的測定采用氣相色譜法，色譜條件為: FFAP毛細管色譜柱0.25 mm×30 m，進樣口溫度為250℃，柱溫為120℃;FID檢測器溫度為250℃;進樣量為0.6 μL，內(nèi)標(biāo)物為體積分數(shù)為2%的正丁醇.

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以乙醇溶液的體積分數(shù)為橫坐標(biāo)，乙醇和正丁醇峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)，曲線的回歸方程為y=0.082 63+3.305x，R=0.999 92.

圖1 乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethanol concentration

2.2 水洗對玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

將稱好的玉米秸稈超細粉按照固液質(zhì)量比1∶10的比例用自來水分別清洗3次和5次，考察水洗對玉米秸稈乙醇發(fā)酵的影響.由圖2可知:隨著水洗次數(shù)的增加，玉米秸稈超細粉水解液發(fā)酵乙醇得率增加.乙醇發(fā)酵72 h，未水洗、洗3次和洗5次的玉米秸稈乙醇發(fā)酵，乙醇得率分別為36.44%、39.44%和41.18%，說明水洗能使玉米秸稈自身帶有的抑制釀酒酵母生長代謝的抑制物去除，使得乙醇得率提高，水洗5次比未水洗秸稈乙醇得率提高了13%.

圖2 水洗對秸稈乙醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of washing on ethanol fermentation

2.3 滅菌對玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

將玉米秸稈超細粉在酶解前分別進行滅菌與不滅菌，考察秸稈微生物對乙醇發(fā)酵的影響.由圖3可知:玉米秸稈超細粉不滅菌比滅菌發(fā)酵乙醇得率高.在滅菌的情況下，雖然乙醇得率直線上升，但是速率較慢，乙醇得率達到最高值耗時較長，發(fā)酵72 h乙醇得率為36.44%;在未滅菌的情況下，前48 h反應(yīng)速率較快，60 h時達到最高值，為39.63%，比滅菌的乙醇得率提高了8.75%.由此可見，秸稈酶解前滅菌會使玉米秸稈產(chǎn)生不利于釀酒酵母生長的物質(zhì)，影響乙醇發(fā)酵得率，因此，玉米秸稈可不需滅菌直接酶解，即提高乙醇得率又節(jié)省時間.

圖3 滅菌對乙醇發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of sterilization on ethanol fermentation

2.4 碳源加入方式對玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

玉米秸稈超細粉有兩種情況提高水解液中葡萄糖含量:一是將秸稈酶解后的水解液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮，二是采用分批加料的方式酶解.考察兩種情況對乙醇發(fā)酵的影響.由圖4可知:釀酒酵母在濃縮后的水解液中消耗葡萄糖較慢，在分批加料水解液中消耗葡萄糖較快，在發(fā)酵結(jié)束時乙醇得率分別為36.44%和47.01%，分批加料水解液比濃縮液乙醇得率提高了29%，說明對水解液進行濃縮雖然能夠提高葡萄糖含量，但在濃縮的同時非揮發(fā)性的抑制物濃度也同步增加，不利于釀酒酵母生長代謝，使得乙醇得率降低，可知玉米秸稈在酶解時可采用分批加料的方式.

圖4 水解液濃縮與分批加料對乙醇發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of two methods on ethanol fermentation

3 結(jié)論

玉米秸稈的水洗次數(shù)、滅菌與碳源加入方式對其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇有一定影響，玉米秸稈超細粉在水洗5次、酶解前不滅菌、通過分批加料的方式得到的水解液發(fā)酵乙醇得率分別為41.18%、39.63%和47.01%，與未水洗、滅菌和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的水解液相比，乙醇得率分別提高了13%、8.75%和29%.

［1］ 班靖洋，張栩，譚天偉.以甜高粱渣為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報，2007，34(6):637－639.

［2］ 何北海，林鹿，孫潤倉，等.木質(zhì)纖維素化學(xué)水解產(chǎn)生可發(fā)酵糖研究［J］.化學(xué)進展，2007，19(7/8): 1141－1146.

［3］ 莊軍平，林鹿，龐春生，等.木質(zhì)纖維素稀水解液脫毒研究進展［J］.現(xiàn)代工業(yè)，2009，29(2):19－23.

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［5］ 劉小杰，郭秀峰，歐凱.利用纖維素酶降解稻草粉的研究［J］.中國食品添加劑，2009(4):99－102.

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［7］ Ghoset T K.Measurement of Cellulase Activities［J］.Pure and Appl.Chem，1987，59(2):257－268.