蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物新纖溶酶的分離純化*

劉曉蘭 張雯舒 鄭喜群 沈媛 孫瑩

(齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006)

血栓性疾病嚴(yán)重危害人類健康，其致殘率和死亡率較高［1］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的溶栓療法是血栓性疾病安全而有效的治療手段［2］.國內(nèi)外已應(yīng)用于臨床使用的溶栓劑(如尿激酶、鏈激酶、葡激酶等)雖藥效較好，但均存在不同程度的副作用，而且價(jià)格昂貴.因而尋找和開發(fā)高效的抗栓溶栓藥物，仍是國內(nèi)外學(xué)者重點(diǎn)關(guān)注的課題.溶栓劑來源十分廣泛;微生物生長速度快，生命活動(dòng)周期短，生長條件容易控制，可以通過人工控制發(fā)酵條件獲取大量的目的產(chǎn)物，從而在產(chǎn)溶栓劑方面展現(xiàn)出廣闊的前景.

蛹蟲草(Cordyceps militaris(L.)Link)又名北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種，與中華冬蟲夏草同屬于真菌門(Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、核菌綱(Pyrenomycetes)、球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)［3］.蛹蟲草在我國的黑龍江、吉林、遼寧等省份均有野生分布［4］，是名貴的食藥兼用大型真菌，且藥理作用十分廣泛［5-8］.蛹蟲草可以生產(chǎn)并分離純化出纖溶酶［9］，筆者推測(cè)由蛹蟲草生產(chǎn)并分離純化出的纖溶酶具有良好的安全可靠性，很有可能成為一種新型的溶栓劑或功能性食品基料，將其用于防治血栓栓塞癥，前景十分廣闊.

純化蛋白的設(shè)備和生產(chǎn)成本相當(dāng)昂貴，在應(yīng)用生物化工、基因工程等方法生產(chǎn)藥用蛋白的生產(chǎn)總成本中，分離和純化要占70%～90%.制備色譜是多數(shù)蛋白純化工藝的必需步驟.與治療蛋白較昂貴的銷售價(jià)格相比，制備色譜是一個(gè)可接受的技術(shù).因色譜技術(shù)的可塑性很強(qiáng)，如果應(yīng)用得當(dāng)，其成本可以大幅降低，所以色譜分離和純化蛋白技術(shù)研究更趨活躍.從每一步色譜分離最優(yōu)化條件來講，涉及固定相、流動(dòng)相、流速、洗脫方式、活性回收率等參數(shù)的選擇.到目前為止，雖有一些規(guī)律可循，但主要還是用實(shí)驗(yàn)方法來確定.

近年來陸續(xù)有學(xué)者對(duì)蛹蟲草子實(shí)體及深層培養(yǎng)產(chǎn)生的纖溶酶進(jìn)行了研究.徐同［9］在人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體時(shí)，發(fā)現(xiàn)生長的菌絲體含有纖溶酶，其采用硫酸銨鹽析、羧甲基(CM)陰離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠過濾對(duì)纖溶酶分離后，初步測(cè)定的纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量為31800.Kim等［10］發(fā)現(xiàn)蛹蟲草子實(shí)體含有纖溶酶，采用二二乙氨乙基－瓊脂糖 (DEAE-Sephadex A-50)、Sephadex G-75和Superdex 75層析從比酶活為3.3 U/mg的子實(shí)體抽提液中分離得到相對(duì)分子質(zhì)量為52000的纖溶酶，酶活回收率為12.9%，比酶活為633 U/mg.崔莉等［11-12］用硫酸銨鹽析和Superdex 75凝膠層析方法從纖溶酶比酶活為0.02U/mg的蛹蟲草深層培養(yǎng)液中分離純化得到新型纖溶酶，酶活回收率為6%，比酶活為 1.77U/mg.宿紅艷等［13］采用鹽析和 DEAESepharose離子交換層析對(duì)液體深層培養(yǎng)產(chǎn)生的纖溶酶進(jìn)行了粗提純，研究了粗酶的部分酶學(xué)性質(zhì).筆者課題組近年來發(fā)現(xiàn)，從大興安嶺地區(qū)采集分離的蛹蟲草經(jīng)深層培養(yǎng)后產(chǎn)生了新的纖溶酶［14］，本研究對(duì)蛹蟲草液體深層發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶的分離純化方法進(jìn)行改進(jìn)，可為蛹蟲草纖溶酶性質(zhì)和功能性試驗(yàn)的開展提供樣品制備的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蛹蟲草菌(Cordyceps militaris)由齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供.牛血纖維蛋白原和牛凝血酶為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血研所產(chǎn)品;低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Marker，14400～97400)購自上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司;丙烯酰胺、N，N'-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Sigma公司;Sephadex G-25填料、Phenyl-Sepharose HP填料、CM-Sepharose FF填料、凝膠過濾色譜預(yù)裝柱Superdex 75(φ1.6cm ×60 cm)、AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)購自美國GE公司.其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)色譜純或分析純?cè)噭?

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶酶活和蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

纖溶酶酶活的測(cè)定參考 Astrup-T［15］血纖維蛋白平板法.采用Lowry法［16］測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.2.2 粗酶液制備方法

培養(yǎng)條件為2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)蔗糖和5%豆餅，250mL錐形瓶裝液量為50 mL，接種量為直徑1cm的菌片1片，23℃、180r/min搖瓶避光培養(yǎng)5d.發(fā)酵液在4℃、10000r/min條件下離心10min，取上清液備用.

1.2.3 硫酸銨鹽析

將發(fā)酵液離心后的上清液硫酸銨飽和度調(diào)至20%，置冰箱(4℃)冷藏12h，在4℃、10000r/min 條件下離心20 min，將上清液與沉淀分離，取上清液備用.

1.2.4 Sephadex G-25 凝膠色譜

用 Sephadex G-25(φ2.6 cm ×30 cm)凝膠過濾色譜對(duì)上述粗酶液進(jìn)行脫色和交換緩沖液.上樣量為20mL，洗脫液為0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4，硫酸銨飽和度為30%)，流速為2mL/min，每管收集6 mL，檢測(cè)纖溶酶酶活和280 nm吸光值D(280)，收集活性組分.

1.2.5 苯基 －瓊脂糖 Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜

用AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進(jìn)行Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜分析.柱型為φ2.6 cm×15cm;起始緩沖液為硫酸銨飽和度為30%的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4);洗脫液為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4);流速為2mL/min;上樣后先用起始緩沖液衡洗3～4倍柱體積，之后用3倍柱體積起始緩沖液和等體積洗脫液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測(cè)D(280)，用AKTA prime自帶的自動(dòng)部分收集器定時(shí)收集洗脫液(每管6mL)，測(cè)定纖溶酶酶活，收集活性組分.

1.2.6 CM-Sepharose FF 弱陽離子交換色譜

將收集的活性部分脫鹽后，用AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進(jìn)行CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜分析.柱型為 φ2.6 cm×15 cm;起始緩沖液為0.02mol/L PBS 緩沖液(pH=6.0 ～7.0);上樣后先用起始緩沖液沖洗未結(jié)合蛋白至D(280)接近0，然后按照NaCl濃度遞增方向采用120mL(150mL)起始平衡緩沖液和120mL(150mL)含0.5mol/L(0.8mol/L)NaCl的洗脫液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為3.0mL/min;檢測(cè)D(280)，自動(dòng)部分收集器定時(shí)收集洗脫液(每管6mL)，測(cè)定纖溶酶酶活，收集活性組分.

1.2.7 Superdex 75 凝膠色譜

將收集的活性組分經(jīng)凍干濃縮后，用AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進(jìn)行Superdex 75凝膠過濾色譜分析.色譜柱為Superdex 7516/60預(yù)裝柱;洗脫液為含 0.8 mol/L NaCl的 0.02 mol/L PBS緩沖液(pH為6.0或7.4);洗脫液體積為140 mL;流速為1.0mL/min;檢測(cè) D(280)，用 AKTA prime 的自動(dòng)部分收集器定時(shí)收集洗脫液(每管1 mL)，測(cè)定纖溶酶酶活，收集活性組分，檢測(cè)纖溶酶純度.

1.2.8 蛹蟲草纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)［17］(12% 分離膠，5% 濃縮膠，交聯(lián)度為2.6%，灌注垂直板凝膠)測(cè)定蛹蟲草纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物由兔磷酸化酶B(97400)、牛血清白蛋白(66200)、雞卵白蛋白(42700)、牛碳酸酐酶(31000)、雞蛋清溶菌酶(14400)組成.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵粗酶液的性質(zhì)

蛹蟲草的液體發(fā)酵以豆餅和蔗糖為主要原料.前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛹蟲草在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一定量的多糖物質(zhì)(3～5 mg/mL).通過發(fā)酵液的多種聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中有十幾種蛋白質(zhì);用疏水層析法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行初步分離并對(duì)纖溶活性進(jìn)行分析的結(jié)果表明，蛹蟲草以豆餅和蔗糖為底物的液體發(fā)酵至少產(chǎn)生了兩種纖溶酶.此外發(fā)酵液含有一定量的色素物質(zhì).這些因素給纖溶酶的分離提純?cè)黾恿穗y度.

2.2 多糖的改進(jìn)硫酸銨鹽析法去除

鹽析是指溶液的離子強(qiáng)度增大到一定數(shù)值時(shí)蛋白質(zhì)溶解度下降、從水溶液中析出的現(xiàn)象.鹽析作用的機(jī)理是，由于中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中大部分甚至全部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，那些與蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)接觸并掩蓋它們的水分子也被移去使得鹽離子被溶劑化，留下暴露出的疏水基團(tuán);隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)疏水表面進(jìn)一步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集而沉淀.鹽析沉淀的蛋白質(zhì)保持著它的天然構(gòu)象，能再溶解［18］.

筆者采用常規(guī)的鹽析方法對(duì)發(fā)酵液中的纖溶酶進(jìn)行初步分離時(shí)，即當(dāng)采用較高飽和度的硫酸銨沉淀纖溶酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)沉淀出的纖溶酶不能用緩沖液復(fù)溶，無法進(jìn)行下一步的分離.進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分的多糖物質(zhì)也在鹽析過程中發(fā)生了沉淀，而且多糖對(duì)鹽析的作用較蛋白質(zhì)敏感.針對(duì)這種情況，考慮采用先將多糖和酶分離開的策略，即采用降低鹽飽和度的方法先去除多糖，再對(duì)酶進(jìn)行分離.當(dāng)粗酶液的硫酸銨飽和度被降低為20%的時(shí)候(置于4℃保持12h)，發(fā)現(xiàn)大部分的多糖形成了絮狀沉淀，而纖溶酶在該鹽濃度下呈鹽溶狀態(tài)，沒有沉淀析出.這樣筆者用離心分離的方法從樣品中除去了大部分蛹蟲草在深層培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的多糖物質(zhì).發(fā)酵液中的多糖物質(zhì)呈溶解狀態(tài)的原因主要是，在靜電力的作用下，多糖分子相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系;在鹽析過程中鹽的加入可能增加了離子與多糖表面電荷的中和，使多糖分子之間的排斥力減弱，分子相互靠攏，與部分蛋白質(zhì)發(fā)生了共沉淀反應(yīng).

很多大型真菌在液體深層發(fā)酵過程中都會(huì)產(chǎn)生多糖物質(zhì)［19-20］，用這種改進(jìn)的鹽析方法從發(fā)酵液中分離多糖物質(zhì)和蛋白質(zhì)是個(gè)可嘗試使用的策略.

2.3 粗酶液的脫色

蛹蟲草以豆餅和蔗糖為主要原料的液體發(fā)酵液中存在一些色素物質(zhì).在酶的色譜分離過程中，色素會(huì)吸附到各種色譜填料上，不易洗脫，從而污染填料，降低填料的載量、分離度和使用壽命.因此，在酶的色譜分離之前最好先去除多數(shù)色素物質(zhì).

Sephadex G-25凝膠過濾填料屬于惰性載體，其相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍為100～5000，不帶電荷，吸附力弱，容易洗脫，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下使用，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持效果較好.因此，利用其對(duì)除去多糖后的粗酶液進(jìn)行脫色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.由圖1可以看出，纖溶活性組分首先被洗脫下來，色素物質(zhì)后洗脫出來，可推測(cè)蛹蟲草的液體發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量大于5000，大部分色素物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較小，已和活性蛋白分離開;此外，Sephadex G-25凝膠過濾還除去了較多的雜蛋白，同時(shí)又能達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行交換緩沖體系的目的，去除色素和分離雜蛋白的效果都比較理想.

圖1 Sephadex G-25凝膠過濾色譜洗脫曲線Fig.1 Elution curves of Sephadex G-25 gel filtration chromatography

2.4 酶的色譜分離

考慮到樣品具有體積量較大、有一定的鹽濃度、待分離的酶濃度較低等特點(diǎn)，又綜合考慮到色譜模式的分離載量、分離度等因素，順次采用Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜、CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜和Superdex 75凝膠色譜對(duì)樣品中的纖溶酶逐步進(jìn)行分離.

Phenyl-Sepharose HP填料表面帶有低密度苯基疏水基團(tuán)，其蛋白上樣條件為高離子強(qiáng)度狀態(tài)，適合于鹽析后的高鹽濃度樣品分離，且這種填料對(duì)蛋白質(zhì)的回收率高，蛋白質(zhì)變性可能性小，流動(dòng)相中不使用有機(jī)溶劑，也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性.洗脫結(jié)果如圖2所示.待分離的酶與疏水填料結(jié)合較好，上樣后的衡洗階段去除了較多的疏水性弱于目標(biāo)纖溶酶的雜蛋白;在硫酸銨飽和度從30%到0線性降低的梯度洗脫過程中分離出兩個(gè)纖溶活性組分，纖溶酶Ⅰ在梯度洗脫的鹽飽和度為15%時(shí)被洗脫下來，纖溶酶Ⅱ的疏水性強(qiáng)于纖溶酶Ⅰ，與填料結(jié)合較牢固，在梯度洗脫接近結(jié)束時(shí)被洗脫下來;纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的活性峰與蛋白峰均對(duì)應(yīng)良好.經(jīng)此步分離得到的纖溶酶Ⅰ的比酶活達(dá)到754.69 U/mg，純化倍數(shù)為28.35，酶活回收率17.38%;纖溶酶Ⅱ的比酶活達(dá)到216.31U/mg，純化倍數(shù)為 8.13，酶活回收率為63.58%，分離效果比較理想.

圖2 Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜洗脫曲線Fig.2 Elution curves of Phenyl-Sepharose HP hydrophobic interaction chromatography

嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)間等電點(diǎn)不同的特點(diǎn)對(duì)纖溶酶繼續(xù)進(jìn)行分離.發(fā)酵液的等電聚焦活性電泳表明，蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶均為堿性蛋白，因此選擇CM-Sepharose FF色譜填料對(duì)纖溶酶Ⅰ和Ⅱ繼續(xù)純化.CM-Sepharose FF填料具有蛋白載量大、結(jié)合能力強(qiáng)、流速快、分辨率較高、物理穩(wěn)定性好等特點(diǎn).由于離子交換色譜要求上樣條件為低離子強(qiáng)度狀態(tài)，先用Sephadex G-25凝膠過濾色譜(φ2.6cm×70cm)對(duì)纖溶酶Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行脫鹽操作，樣品凍干濃縮后進(jìn)行CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜分離.樣品和洗脫液的pH值均為6.0，梯度洗脫NaCl濃度范圍為0～0.5mol/L.纖溶酶Ⅰ在離子強(qiáng)度為0 ～0.5mol/L的線性梯度洗脫階段被洗脫下來，說明纖溶酶Ⅰ在pH=6.0的條件下帶正電荷，其等電點(diǎn)pI一定大于7.纖溶酶Ⅱ在低離子強(qiáng)度的衡洗階段先被洗脫下來，未與填料結(jié)合，說明纖溶酶Ⅱ在pH=6.0的條件下不帶正電荷或帶正電荷量較少.纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的酶活回收率分別為8.60%和11.43%，比酶活分別為1045.49 U/mg 和 454.83 U/mg，純化倍數(shù)分別為1.38 和 2.10.

圖3 纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的Superdex 75凝膠過濾色譜洗脫曲線Fig.3 Elution curves of fibrinolytic enzymeⅠ and Ⅱ by Superdex 75 gel filtration chromatography

用Superdex 75凝膠色譜對(duì)纖溶酶Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行精細(xì)分離.Superdex 75凝膠填料膠粒直徑只有13μm，分辨率高，可分離相對(duì)分子量范圍為3000～70000.Superdex 75凝膠色譜對(duì)纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的分離圖譜見圖3.從圖3可看出，Superdex 75凝膠色譜對(duì)纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的分離效果均比較理想，目標(biāo)蛋白峰與雜質(zhì)蛋白峰分開，目標(biāo)蛋白峰型對(duì)稱，基線良好，與活性峰完全對(duì)應(yīng).純化后的纖溶酶Ⅰ比酶活達(dá)到1699.73 U/mg，純化倍數(shù)為 1.62，酶活回收率為0.43%;纖溶酶Ⅱ比酶活達(dá)到 800.46 U/mg，純化倍數(shù)為1.76，酶活回收率為 1.02%.

經(jīng)SDS-PAGE方法檢測(cè)，纖溶酶Ⅰ和纖溶酶Ⅱ均呈現(xiàn)單一條帶，表明樣品達(dá)到電泳純.

2.5 酶色譜分離方法的改進(jìn)

纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的酶學(xué)性質(zhì)研究、功能性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)均需要較多的高純度樣品，因此改善酶的分離效率、提高酶活回收率非常必要.

在上述的纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜分離過程中，酶活回收率偏低，酶活損失較多.推測(cè)可能是流動(dòng)相PBS緩沖液的pH與樣品的穩(wěn)定pH相差較多，導(dǎo)致酶活下降較多.嘗試改變樣品分離條件，期望酶的分離效率和酶活回收率有所改善.

在纖溶酶Ⅰ的分離中，如果提高樣品和緩沖液的pH值，則有利于酶空間結(jié)構(gòu)的保持，即有利于酶活的保持，但同時(shí)有可能使酶的帶正電荷量下降，不利于其與填料的初始結(jié)合.如果提高線性洗脫的終點(diǎn)鹽濃度，在相同上樣量的前提下，可以使活性組分的洗脫體積量減少，酶濃度增加，也有利于酶活的保持.如果將Phenyl-Sepharose HP疏水色譜分離后的樣品不進(jìn)行凍干濃縮操作，脫鹽后直接進(jìn)行CMSepharose FF弱陽離子交換色譜，可能減少樣品在凍干濃縮過程中的酶活損失.為此，不改變Phenyl-Sepharose HP疏水色譜分離，提高CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜中PBS緩沖液的pH值至6.5，對(duì)纖溶酶Ⅰ進(jìn)行分離，結(jié)果見圖4(a).從圖4(a)中可以看出，纖溶酶Ⅰ在上樣初始條件下仍與填料充分結(jié)合，在梯度洗脫中期被洗脫下來，活性峰與蛋白峰對(duì)應(yīng)良好.同時(shí)，目標(biāo)蛋白與其等電點(diǎn)接近的雜蛋白基本分離，使纖溶酶Ⅰ得到了進(jìn)一步的純化.纖溶酶Ⅰ比酶活達(dá)到1288.45U/mg，酶活回收率為35.53%，較pH值為6.0時(shí)提高約3倍.提高PBS緩沖液pH值至6.8和7.0繼續(xù)優(yōu)化.

當(dāng)將緩沖液pH值調(diào)節(jié)至6.8和7.0時(shí)，纖溶酶Ⅰ均不能與填料結(jié)合，纖溶酶在這樣的pH條件下不帶正電荷或正電荷量少，不利于酶的分離.將梯度洗脫NaCl濃度范圍調(diào)整至0～0.8mol/L，酶活回收率和純化倍數(shù)均有提高，分別為40.35%和32.05%.由此確定酶Ⅰ進(jìn)行CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜時(shí)PBS緩沖液的pH值為6.5，梯度洗脫NaCl濃度范圍為0～0.8mol/L.

在纖溶酶Ⅱ的分離中，由于其在pH=6.0條件下只帶少量的正電荷，不足以和離子交換色譜填料吸附牢固，如果再降低樣品和緩沖液的pH值，勢(shì)必使其更偏離其最適pH范圍，丟失更多酶活的可能性較大.因此，只采取纖溶酶Ⅰ分離的第3個(gè)改進(jìn)措施，即將Phenyl-Sepharose HP疏水色譜分離后的樣品不進(jìn)行凍干濃縮操作，脫鹽后直接進(jìn)行CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜操作，減少樣品在凍干濃縮過程中的酶活損失.

圖4(b)為改進(jìn)條件后纖溶酶Ⅱ的離子交換洗脫圖譜.由圖4(b)可以看出，纖溶酶Ⅱ在衡洗階段被洗脫下來，但與較多的在該條件下不帶電荷或帶負(fù)電荷的雜蛋白得到了很好的分離，蛋白質(zhì)濃度峰與活性峰對(duì)應(yīng)良好，同樣得到了較好的分離效果.纖溶酶Ⅱ達(dá)到比酶活893.76U/mg，酶活回收率為25.48%.

圖4 纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜洗脫曲線Fig.4 Elution curves of fibrinolytic enzymeⅠandⅡby CMSepharose FF weak-cation exchange chromatography

纖溶酶Ⅰ和Ⅱ經(jīng)Superdex 75凝膠層析洗脫后，目的蛋白峰與雜質(zhì)峰分開，對(duì)稱效果良好，并且與活性峰完全對(duì)應(yīng)，纖溶酶Ⅰ和Ⅱ得到更加精細(xì)的純化，纖溶酶Ⅰ比酶活達(dá)到1467.44U/mg，酶活回收率為5.79%，純化倍數(shù)為36.07(見表1).纖溶酶Ⅱ比酶活達(dá)到1681.58U/mg，酶活回收率為4.00%，純化倍數(shù)為41.33(見表2).

表1 蛹蟲草纖溶酶Ⅰ的純化結(jié)果Table 1 Purification results of fibrinolytic enzymeⅠfrom Cordyceps militaris

表2 蛹蟲草纖溶酶Ⅱ的純化結(jié)果Table 2 Purification resluts of fibrinolytic enzymeⅡfrom Cordyceps militaris

2.6 蛹蟲草纖溶酶的純度檢驗(yàn)和相對(duì)分子質(zhì)量確定

要使用一種以上的方法檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的純度.蛹蟲草纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的最后一步色譜分離采用的凝膠色譜柱為Superdex 75預(yù)裝柱，該柱內(nèi)填料的粒度只有13μm，分辨率很高.用該凝膠柱分離纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的圖譜表明這兩個(gè)酶均已達(dá)到相當(dāng)高的純度.纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的SDS-PAGE電泳選擇的膠濃度為12%，上樣濃度為2 mg/mL.如圖5所示，提純后的纖溶酶Ⅰ和Ⅱ均達(dá)到電泳純，利用凝膠成像系統(tǒng)的Labworks軟件分析得出兩個(gè)酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為28000和32000.Deng等［21］從日本沙蠶中分離出的纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量為28000～32000，Wu等［22］從鐮孢菌中提取的纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量為28000，這些酶與本實(shí)驗(yàn)中提取的蛹蟲草纖溶酶Ⅰ的相對(duì)分子質(zhì)量相近，但Kim等［10］從蛹蟲草中提取的纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)52000.蛹蟲草纖溶酶Ⅱ的相對(duì)分子質(zhì)量與枯草芽孢桿菌中提取的纖溶酶(31500)［23］和海洋綠藻中提取的纖溶酶(31000)［24］相近.

圖5 純化后蛹蟲草纖溶酶的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE profile of the purified fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris

3 結(jié)語

以本課題組已優(yōu)化的蛹蟲草深層發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶條件為基礎(chǔ)，獲得了適合純化蛹蟲草纖溶酶的分離方法.發(fā)酵液經(jīng)過離心除雜后，用改進(jìn)的硫酸銨鹽析除去多糖和部分雜蛋白;得到的樣品采用Sephadex G-25凝膠過濾色譜脫色并交換緩沖溶液，經(jīng)Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜分離后得到兩種纖溶酶Ⅰ和Ⅱ;然后利用CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜和Superdex 75凝膠過濾色譜進(jìn)一步分離純化，最后所得產(chǎn)物均達(dá)到電泳純，蛹蟲草纖溶酶Ⅰ和Ⅱ的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為28000和32000.提純后的蛹蟲草纖溶酶Ⅰ比酶活為1467.44 U/mg，總純化倍數(shù)為36.07，酶活回收率為5.79%;蛹蟲草纖溶酶Ⅱ比酶活達(dá)到1681.58U/mg，總純化倍數(shù)為41.33，酶活回收率為 4.00%.

［1］ 魯艷麗，寧喜斌.血栓形成機(jī)理及溶血栓藥物的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(1):169-172.Lu Yan-li，Ning Xi-bin.The mechanism of thrombus and the advances in research of thrombolitics［J］.Food Research and Development，2006，27(1):169-172.

［2］ 葉杰，于金蘭.溶栓、抗凝在腦梗死中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.人民軍醫(yī)，2004，47(12):738-739.Ye Jie，Yu Jin-lan.Research progress of the application of thrombolysis and anticoagulation to cerebral infarction［J］.People's Military Surgeon，2004，47(12):738-739.

［3］ Alexopoulos C J，Mims C W，Blackwell M.Introductory mycology［M］.Beijing:China Agriculture Press，2002:293-294.

［4］ 趙榮艷，段毅，郜俊紅.蛹蟲草的研究和產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(24):6528-6529.Zhao Rong-yan，Duan Yi，Gao Jun-hong.The research and product development progress of Cordyceps militaris［J］.Anhui Agricultural Science，2006，34(24):6528-6529.

［5］ 貢成良，潘中華，鄭小堅(jiān)，等.家蠶蛹蟲草的延緩衰老作用研究［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(2):24-27.Gong Cheng-liang，Pan Zhong-hua，Zheng Xiao-jian，et al.Anti-aging effect of silkworm Cordyceps militaris［J］.Suzhou University，2005，25(2):24-27.

［6］ 秦建春，李曉明，張鞍靈，等.蛹蟲草發(fā)酵液抗茵活性初步研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(2):402-406.Qin Jian-chun，Li Xiao-ming，Zhang An-ling，et al.The antimicrobial activity of fermented liquid from Cordyceps militaris［J］.Northwest of Plants，2006，26(2):402-406.

［7］ 陳國剛，徐承智，貢成良，等.人工培育家蠶蛹蟲草海寧株的藥理學(xué)研究［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11(4):453-458.Chen Guo-gang，Xu Cheng-zhi，Gong Cheng-liang，et al.The pharmacological research of home pupa Cordyceps militaris from Haining［J］.Application and Environmental Biological Journals，2005，11(4):453-458.

［8］ 劉春泉.北冬蟲夏草多糖組分的分離純化及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2007，28(1):370-373.Liu Chun-quan.North Cordyceps polysaccharides research progress on separation and structure ［J］.Food Science，2007，28(1):370-373.

［9］ 徐同.蛹蟲草人工培育和蛹蟲草纖溶酶部分性質(zhì)的研究［D］.上海:華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2003:5-6.

［10］ Kim J K，Sapkota K，Park S E，et al.A fibrinolytic enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris［J］.The Journal of Microbiology，2006，44(6):622-631.

［11］ 崔莉.蛹蟲草纖溶酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及溶栓抗栓作用研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，2008:41-59.

［12］ Cui L，Dong M S，Chen X H，et al.A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris，a Chinese traditional medicinal mushroom［J］.World Journal of Microbiology Biotechnology，2008，24(4):483-489.

［13］ 宿紅艷，劉金星，王磊，等.蛹蟲草纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究 ［J］.食品科學(xué)，2009，30(21):221-224.Su Hong-yan，Liu Jin-xing，Wang Lei，et al.Characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris［J］.Food Science，2009，30(21):221-224.

［14］ 劉曉蘭，鄭喜群，鄧永平，等.一種真菌纖溶酶及其培制方法:中國，200810137564.4［P］.2009-08-12.

［15］ Astrup T，Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Archive of Biochemistry and Biophysics，1952，40(2):346-351.

［16］ Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193(1):264-275.

［17］ 郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:科學(xué)出版社，2005:92-118.

［18］ 佰吉頓.蛋白質(zhì)純化指南(第二版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2011:331-345.

［19］ 李春麗，劉曉蘭，陳慧鑫，等.蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)菌絲體和胞外多糖的初步研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，2(2):22-26.Li Chun-li，Liu Xiao-lan，Chen Hui-xin，et al.Elementary study on the submerged culture conditions for micellium and exopolyasccharides production by Cordyceps militaris［J］.Innovational Edition of Farm Products Processing，2010，2(2):22-26.

［20］ Lee S H，Hwang H S，Yun J W.Production of polysaccharides by submergedmycelial culture of entomopathogenic fungus Cordyceps takaomontana and their apoptotic effects on human neuroblastoma cells［J］.Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26(4):1075-1083.

［21］ Deng Z H，Wang S H，Li Q，et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from the polychaete，Neanthes japonica(Iznka) ［J］.Bioresource Technology，2010，101(6):1954-1960.

［22］ Wu B，Wu L C，Chen D J，et al.Purification and characterization of a novel fibrinolytic protease from Fusarium sp.CPCC 480097［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆Biotechnology，2009，36(3):451-459.

［23］ Chang C T，F(xiàn)an M H，Kuo F C，et al.Potent fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(8):3210-3216.

［24］ Matsubara K，Hori K，Matsuura Y，et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme and identification of fibrinogen clotting enzyme in a marine green alga，Codium divaricatum ［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology，2000，125(1):137-143.