一株珙桐內(nèi)生細(xì)菌GT21的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

馬莉莉，張宇美，宋培勇

（1.湄潭縣求是高級(jí)中學(xué)，貴州湄潭564106；2.廣東海洋大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東湛江5240883；3.遵義師范學(xué)院生物系，貴州遵義563002）

植物內(nèi)生菌指生活在植物體內(nèi)而一般不引起植物病害的微生物的總稱，包括真菌、細(xì)菌和放線菌，是一類潛在的寶貴的微生物資源，具有增強(qiáng)宿主植物抗逆性、抗病蟲害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等作用以及用于轉(zhuǎn)基因操作等。內(nèi)生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制是通過(guò)生物固氮、產(chǎn)生植物激素、增強(qiáng)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收、抑制植物病原體等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Ryu等還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生細(xì)菌一種新的促生長(zhǎng)機(jī)制：產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)如2，3-丁二醇和Aceotin來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1]。Downing等和Turner等報(bào)道了轉(zhuǎn)基因工程內(nèi)生細(xì)菌Herbaspirillum serope dicae和Clavibacter xylii能產(chǎn)生并分泌原本為蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的對(duì)多種昆蟲幼蟲有毒殺作用的δ-內(nèi)毒素[2，3]。迄今雖然已有很多植物內(nèi)生菌的報(bào)道，但是有關(guān)珙桐內(nèi)生菌的報(bào)道較少，何映霞等報(bào)道了從珙桐中分離到一株產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌Asper-gillus fumigatus[4]，宋培勇等對(duì)從珙桐中分離到的15株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[5]。對(duì)珙桐等珍稀植物進(jìn)行內(nèi)生菌分離鑒定并加以深入研究，不但可以了解其內(nèi)生菌生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特征及其與宿主植物相互關(guān)系等，而且從中還可能篩選出具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的生防菌株或產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的菌株，為珙桐等珍稀野生植物資源的保護(hù)和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。本文以從珙桐中分離到的一株內(nèi)生細(xì)菌為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗(yàn)所用菌株GT21，由遵義師范學(xué)院生物系微生物實(shí)驗(yàn)室提供，從采自貴州寬闊水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的珙桐葉柄中分離而得。

1.1.2 主要試劑和儀器

試驗(yàn)中所用的PCR擴(kuò)增引物為：27f:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1525r:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′（生工）。2×Taq PCR MasterMix（天根），膠回收試劑盒（Omega），PCR擴(kuò)增儀（BioRad），WD-9413A凝膠成像系統(tǒng)（北京六一）。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、脲酶測(cè)定培養(yǎng)基和卵磷脂酶測(cè)定培養(yǎng)基以及V-P反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)等培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌GT21轉(zhuǎn)接

利用無(wú)菌操作技術(shù)從斜面挑取少量菌苔劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)出單菌落。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)：觀察菌落的大小、顏色、質(zhì)地、邊緣、凸起、干濕、光澤等特征。

細(xì)胞形態(tài)：參考文獻(xiàn)[6]介紹的方法對(duì)供試菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察，用孔雀綠染色觀察芽孢。1.2.3生理生化鑒定

接觸酶、脲酶、卵磷脂酶測(cè)定，V-P反應(yīng)，甲基紅試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)以及耐鹽性試驗(yàn)等按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.4 16S rDNA PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基因組DNA提取按文獻(xiàn)[7]介紹的水煮法進(jìn)行。16S rDNA PCR擴(kuò)增體系和條件見文獻(xiàn)[5]。

凝膠電泳檢測(cè)16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果，用凝膠回收試劑盒切膠純化后，交北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.2.5 同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

登錄NCBI用BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與Gen－Bank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，查找相似性最高的菌種，取相似性最高的5株同源菌株和1株蘇云金芽孢桿菌與GT21的16S rDNA序列，用MEGA4.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)鑒定

菌株GT21在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成的菌落較薄，橢圓形或近圓形，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，不透明。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞呈桿狀。芽胞為橢圓形或柱狀，端生或次端生。

2.2 生理生化鑒定

對(duì)菌株GT21進(jìn)行了13項(xiàng)生理生化測(cè)試，結(jié)果列于表1。

表1 菌株GT21生理生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 耐鹽性試驗(yàn)

耐鹽性試驗(yàn)表明，待測(cè)菌株能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%，13%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%和9%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化特征，并與文獻(xiàn)[8]記錄的芽孢桿菌屬（Bacillus）的所有種進(jìn)行一一比較，發(fā)現(xiàn)該菌株與該菌屬的所有種不一致。

2.416 S rDNA的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

GT21菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1500bp左右，實(shí)際測(cè)序結(jié)果為1293個(gè)核苷酸（Nt）（見圖1），其中左圖為16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果：M為200bp DNA Ladder，21指珙桐內(nèi)生菌株GT21；右圖為16S rDNA測(cè)序結(jié)果。

輸入測(cè)序結(jié)果（查詢號(hào)NS9GUZHR013），利用BLAST進(jìn)行搜索比對(duì)，查找相似性最高的同源菌株，發(fā)現(xiàn)與其相似性最高的同源菌株為Bacillus sp.SAP02_1（注冊(cè)號(hào)：JN872500），相似性97%。取相似性最高的前5株同源菌株：Bacillus sp.SAP02_1（注冊(cè)號(hào)JN872500），Bacillus sp.MB1（2011）（注冊(cè)號(hào)HQ600985）、Bacillus sp.LM6（注冊(cè)號(hào)JN208185）、Bacillus sp.BM3（2011）（注冊(cè)號(hào)JF825991）、Bacillus sp.PKSWII（注冊(cè)號(hào)F768713）以及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）（注冊(cè)號(hào)FN433029）和GT21共7株細(xì)菌的16S rDNA序列，利用Mega4.0軟件構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），GT21單獨(dú)一支，其余6株細(xì)菌聚為一支，GT21與Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6親緣關(guān)系較近，而與Bacillus sp.SAP021、Bacillus sp.BM1（2011）等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 GT2116S rDNA的PCR擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

圖2 GT21及其同源菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與展望

對(duì)從珙桐中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌GT21進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征等系統(tǒng)研究，并結(jié)合分子鑒定結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)[8]將其初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus），與文獻(xiàn)中記錄的種不一致，是否為一新種，有待進(jìn)一步鑒定。根據(jù)16S rDNA測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行相似性搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其相似性最高的菌株為Bacillus sp.SAP02_1，相似性為97%。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)GT21與Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6親緣關(guān)系更近，而與Bacillus sp.SAP02_1等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

芽孢桿菌的分布和應(yīng)用較廣，如在農(nóng)業(yè)上，蘇云金芽孢桿菌是生防菌的典型代表。在釀造工業(yè)上，羅俊成從濃香型白酒糟醅中分離并鑒定了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）以及蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）[9]。在醫(yī)藥工業(yè)上，地衣芽孢桿菌是人用微生物制劑“整腸生”的主要成分。在飼料工業(yè)上，芽孢桿菌也是飼用微生物制劑“益生素”、“EM”等的主要成分之一[10]。在教學(xué)和科研上，枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等是常用的菌株。

植物內(nèi)生菌的分離可能因取樣、表面消毒及培養(yǎng)基的不同，其數(shù)量和種類往往存在較大差異，僅僅依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，想無(wú)偏好的分離到植物體內(nèi)大多數(shù)的內(nèi)生菌（更不用說(shuō)所有的內(nèi)生菌）是不現(xiàn)實(shí)的。令人興奮的是關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究方法目前已取得重大進(jìn)展，中科院昆明植物研究所曾英研究組利用宏基因組學(xué)方法研究了滑桃樹（Trewia（nudiflora）內(nèi)生菌，在世界上首次建立了植物內(nèi)生菌宏基因組文庫(kù)[11]。隨著宏基因組學(xué)的發(fā)展和相關(guān)技術(shù)的成熟和完善，宏基因組學(xué)用于植物內(nèi)生菌研究將更加廣泛。

[1] Ryu CM，F(xiàn)aragM A，Hu CH，etal.Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis[J].PNAS，2003，100（8）:4927-4932.

[2] Downing K J，Leslie G，Thomson J A.Biocontrol of the sugarcane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thuringiensis cry1Ac7 and Serratia marcescens chiA genes in sugarcane-associated bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（7）:2804-2810.

[3] Turner J T，Lampel J S，Stearman R S，et al.Stability of the δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.kurstakiin a recombinant strain of Clavibacterxyli subsp.Cynodontis[J].Appl Environ Microbiol，1991，57（12）:3522-3528.

[4] 何映霞，冉雪琴，王嘉福.珙桐產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離和鑒定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（3）:3-6.

[5] 宋培勇，李鳳華，馬莉莉.珙桐內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）:8-13.

[6] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1983.

[7] 陶天申，楊瑞馥，東秀珠.原核生物系統(tǒng)學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[8] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第8版）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.29-758.

[9] 羅俊成.濃香型白酒糟醅中芽孢桿菌屬細(xì)菌的分類鑒定和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[10] 孫建義，許梓榮.芽孢桿菌的分離、鑒定及應(yīng)用研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，11（1）:47-50.

[11] JY Jiao，H X Wang，Y Zeng，et al.Enrichment formicrobes living in association with plant tissues[J].JAppl Microbiol，2006，100（4）:830-837.