氧化應(yīng)激下傷寒沙門菌誘導的巨噬細胞凋亡＊

劉婷婷，馬麗娜，李鳳云，劉 勇

傷寒沙門菌（Salmonella typhi）是重要的腸道致病菌，屬胞內(nèi)寄生菌，可引起傷寒等嚴重疾病。巨噬細胞是人體主要的吞噬細胞，在許多病原體的清除和破壞中起重要作用。傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)生存、增殖的能力與其致病密切相關(guān)。傷寒沙門菌侵襲性蛋白Sip－B可以誘導caspase1介導的巨噬細胞凋亡［1］，但這些細菌毒力因子的表達在宿主體內(nèi)、外是不同的［2］，人體內(nèi)環(huán)境因素對傷寒沙門菌誘導細胞凋亡的影響還有待于進一步研究，其中就包括傷寒沙門菌被巨噬細胞吞噬后所遭遇的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境。本實驗擬用H2O2刺激傷寒沙門菌以模擬體內(nèi)氧化條件，采用人單核細胞株經(jīng)PMA分化的巨噬細胞為模型，探討傷寒沙門菌在氧化應(yīng)激狀態(tài)下誘導的巨噬細胞凋亡，以深入了解傷寒沙門菌的致病機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種 傷寒沙門菌標準菌株ATCC 19430，購自北京中國藥品生物制品鑒定所；氧化應(yīng)激傷寒沙門菌，參照文獻［3］方法制備。

1．1．2 主要試劑 Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒（深圳晶美生物工程公司），人TNFα定量酶聯(lián)檢測試劑盒（上海森雄生物技術(shù)有限公司），SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1．1．3 主要儀器 流式細胞儀FACS Calibur（美國BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 用含小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人單核細胞株，加入20ng／mL使其分化，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h，鏡下觀察90%以上細胞出現(xiàn)棘狀突起時判定細胞已分化成巨噬細胞。收獲指數(shù)生長期巨噬細胞，以5×105接種于無菌6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)5h后更換不含小牛血清的營養(yǎng)液進行試驗。

1．2．2 細菌培養(yǎng) 細菌分別在LB液體培養(yǎng)基和加有15mmol／L H2O2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，16h后使用酶標儀測A600值；計算菌液濃度，用不含小牛血清的RPMI－1640調(diào)整菌液濃度。

1．2．3 細胞感染 棄去細胞培養(yǎng)孔中陳舊培養(yǎng)液，加入1．0mL不含小牛血清營養(yǎng)液，按細菌與細胞數(shù)之比為20∶1加入細菌。實驗分為A組（傷寒沙門菌誘導組）、B組（氧化應(yīng)激組）和C組（空白對照組）。

1．2．4 細胞凋亡檢測 分別于感染細菌后2、4、8、12h收集細胞，Annexin V－FITC染色，1h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡，Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)。

1．2．5 TNF－α、SOD檢測 細菌感染8h后收集細胞培養(yǎng)上清，采用定量酶聯(lián)法檢測TNF－α，按照說明書操作，用酶標儀測A492值，根據(jù)標準曲線得到TNF－α含量。SOD的檢測采用黃嘌呤氧化酶法檢測細菌感染8h細胞培養(yǎng)液上清，用可見光分光光度計在550nm處檢測，通過公式可求出樣本SOD活力。1．2．6 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel和SPSS10．0進行計算和分析。采用one－way ANOVA后t檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡的流式分析 各時間段氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌均可誘導巨噬細胞凋亡，與對照組相比細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），隨時間延長，各組細胞凋亡率亦相應(yīng)增加（P＜0．01）；各時間段氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡率與自然狀態(tài)傷寒沙門菌組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。

圖1 巨噬細胞凋亡的流式圖A：對照組；B：自然狀態(tài)傷寒沙門菌組；C：氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌組）Fig．1 Time－dependent effect of macrophage apoptosis inducedA：control；B：s．typhi；C：H2O2stressed s．typhi with flow cytometry

圖2 氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門菌及自然狀態(tài)下傷寒沙門菌誘導巨噬細胞不同時間的細胞凋亡率 （ni＝6，±s）＊：與自然狀態(tài)傷寒沙門菌組及對照組比較Fig．2 Apoptosis rates of macrophage induced by S．typhi grown under normal and H2O2stressed conditionCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

2．2 細菌誘導8h后TNF－α及SOD的產(chǎn)生量氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌及自然狀態(tài)傷寒沙門菌組誘導巨噬細胞8h后，TNF－α的產(chǎn)生量均比加入誘導因素前明顯增高，且氧化應(yīng)激菌TNF－α高于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組；SOD的產(chǎn)生量均比加入誘導因素前明顯減少，且氧化應(yīng)激菌SOD的產(chǎn)生量均低于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組，見圖4－6。

圖3 自然狀態(tài)傷寒沙門菌及氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞TNF－α產(chǎn)生量 （ni＝6，±s）＊：與對照組及自然狀態(tài)傷寒沙門菌作用巨噬細胞組比較Fig．3 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages，P＜0．01

3 討 論

圖4 自然狀態(tài)傷寒沙門菌及氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌誘導巨噬細胞SOD產(chǎn)生量 （ni＝6，±s）＊：與對照組及自然狀態(tài)傷寒沙門菌作用巨噬細胞組比較Fig．4 Production of TNF－αafter 8hin the culture supernantants of macrophages interacted with S．typhi under normal and H2O2stressed conditionsCompared to control and normal S．typhi infected macrophages），P＜0．01

氧化應(yīng)激即機體活性氧（reactive oxygen specises，ROS）產(chǎn)生過多或／和抗氧化能力下降，ROS清除不足，導致ROS在體內(nèi)過多堆積而造成細胞損傷。感染過程中，在細胞因子的影響下，傷寒沙門菌遭遇了巨噬細胞內(nèi)的氧化環(huán)境，巨噬細胞利用其產(chǎn)生的氧衍生物分子以抑制或殺死傷寒沙門菌，但仍有部分傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)生存并導致感染。為了應(yīng)對環(huán)境的應(yīng)激，傷寒沙門菌經(jīng)歷了遺傳以及物理性狀的改變。這些應(yīng)激反應(yīng)可能會顯著的增強傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的生存能力及毒性［4］。本實驗著重探討了傷寒沙門菌如何應(yīng)對巨噬細胞內(nèi)的氧化環(huán)境以及巨噬細胞凋亡與ROS之間的關(guān)系。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下自然狀態(tài)傷寒沙門菌，采用Annexin V－FITC染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果兩組細菌均可誘導巨噬細胞凋亡，且細胞凋亡率隨時間延長而增高（P＜0．01），各組氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌引發(fā)巨噬細胞凋亡能力均高于自然狀態(tài)傷寒沙門菌組，說明模擬巨噬細胞內(nèi)氧化應(yīng)激條件傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡能力增強。

本實驗結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激狀態(tài)傷寒沙門菌組較自然狀態(tài)傷寒沙門菌感染組誘導巨噬細胞產(chǎn)生的SOD明顯降低。SOD是一種重要的抗氧化酶，具有清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的作用。SOD水平的下降可能引起過氧化自由基的產(chǎn)生從而引起巨噬細胞的凋亡，已經(jīng)有報道這種過氧化物可引起神經(jīng)細胞的凋亡［5］。早期的研究中有人發(fā)現(xiàn)，缺乏SOD的大腸桿菌在需氧生長中突變率增強，這表明缺乏SOD可導致DNA的損害。另外，SOD的顯著減少有可能阻礙了超氧陰離子防止突變以及H2O2的解毒作用，因而可能造成凋亡的羥基離子和其他活性氧成分的形成［6］。

許多研究已證實氧化應(yīng)激可引起細胞凋亡，這其中凋亡可由活性氧中間物產(chǎn)生，也可由抗氧化劑的使用而被阻止。TNF－α就是這樣一種調(diào)劑因子。Larrick和Wright曾報導給予TNF受體刺激后可導致細胞內(nèi)活性氧中間物水平的迅速上升［7］。而且在不同的細胞，TNF－α介導的細胞凋亡可由硫氧化還原劑，或 N－已酰半胱氨酸，和GSH 前體所抑制［8］。TNF－α，INF－α和IL－1也曾經(jīng)被報道可引起不同類型細胞凋亡［9］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激下傷寒沙門菌組較原菌感染組誘導巨噬細胞釋放的TNF－α明顯增多，這個結(jié)果跟Hirose早期研究發(fā)現(xiàn)細胞對TNF－α敏感度和抵抗力是和SOD水平的降低或升高密切相關(guān)是一致的，SOD缺陷的T細胞已被證實更易被 TNF－α殺傷［10］。

氧化應(yīng)激狀態(tài)下傷寒沙門菌可誘導巨噬細胞凋亡，TNF－α在傷寒沙門菌氧化應(yīng)激時通過增加ROS和減少抗氧化物SOD的產(chǎn)生來介導巨噬細胞凋亡，本研究結(jié)果有助于我們更好的理解傷寒沙門菌的致病機理，為我們進一步的診斷與治療提供了新的思路。

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