淡色庫(kù)蚊kdr等位基因突變及抗藥性檢測(cè)方法的研究＊

劉宏美，代玉華，王海防，程 鵬，黃曉丹，劉麗娟，趙玉強(qiáng)，王懷位，公茂慶

淡色庫(kù)蚊（Culexpipienspallens）是北方地區(qū)班氏絲蟲(chóng)和乙型腦炎的主要傳播媒介，影響著人們的身體健康［1］?；瘜W(xué)防治是殺滅蚊蟲(chóng)最重要的方法，尤以高效的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑為主。然而，該類殺蟲(chóng)劑連續(xù)過(guò)度的使用引起了蚊蟲(chóng)抗藥性的迅猛發(fā)展，藥效急劇下降。研究表明擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性產(chǎn)生與蚊蟲(chóng)的神經(jīng)軸突鈉離子通道（sodiumchannel，SC）第Ⅱ結(jié)構(gòu)域S6節(jié)段1014位點(diǎn)的點(diǎn)突變密切相關(guān)，其引起的抗性表型稱之為靶標(biāo)抗性（targetsiteresistance）又稱擊倒抗性（knockdown resistance，kdr）［2］。學(xué)者們首先在岡比亞按蚊（A－nophelesgambiae）和 致 倦 庫(kù) 蚊，（Culexpipiens quinquefasciatus）發(fā)現(xiàn)了 L1014F型突變［3］，后在阿拉伯按蚊（Anophelesarabiensis）幼蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)L1014S型突變［4］，該位點(diǎn)上的堿基“T”突變?yōu)椤癈”，相應(yīng)的亮氨酸被絲氨酸取代。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 樣本 淡色庫(kù)蚊自然種群試驗(yàn)蚊蟲(chóng)采自山東省濟(jì)南、濟(jì)寧和青島的監(jiān)測(cè)點(diǎn)。敏感種群來(lái)在山東省疾病預(yù)防控制中心。采用羽化后1～3d的雌蚊做WHO成蚊接觸筒法生物活性測(cè)定。

1．2 試劑 溴氰菊酯（99．0%），購(gòu)自德國(guó) Dr．Ehrenstorfer公司，總DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司，蛋白酶抑制劑、Pyrobest DNA Polymerase、dNTP、RNA 酶、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)2000均購(gòu)自Takara公司，引物由AUGCT公司合成，白油，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1．2 方 法

1．2．1 WHO成蚊接觸筒法 采用 WHO標(biāo)準(zhǔn)藥膜（將白油和乙醚按1∶2的體積配比的混合物與溴氰菊酯混合，吸取3mL滴于16×12．5cm的新華Ⅰ號(hào)濾紙上，其溴氰菊酯濃度為0．05%）。以WHO區(qū)分劑量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，記錄接觸10、15、20、30、40、50、60min時(shí)蚊蟲(chóng)的擊倒數(shù)量。將接觸藥膜60min后的受試蚊吹入恢復(fù)筒，以10%的葡萄糖水飼養(yǎng)24h，記錄成蚊的死亡數(shù)和存活數(shù)，收集－70℃保存，用于提取DNA。

1．2．2 成蚊基因組DNA提取 選取濟(jì)南、青島、濟(jì)寧及敏感種群的受試紋，分為敏感組（死亡）和抗性組（存活）淡色庫(kù)蚊，共418只。用QIAGEN公司的DNeasy Blood﹠Tissue Kit試劑盒按其步驟提取單蚊基因組DNA。

1．2．3kdr基因擴(kuò)增 以淡色庫(kù)蚊鈉離子通道cDNA為模板，應(yīng)用Primer primier 5．0軟件，設(shè)計(jì)特異性引物為 C1 5′－CCTGCCACGGTGGAACTTC－3′，C2 5′－GGACAAAAGCAAGGCTAAGAA－3′。反應(yīng)體系為50μL，含有10×Pyrobest Buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase，0．25μL；dNTP，4 μL；基因組 DNA、C1、C2各1μL；ddH2O，37．75 μL。94℃，5min；94℃，40s，55℃，50s，72℃，

1min，32個(gè)循環(huán)；72℃，8min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1．2．4 DNA片段純化 按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行純化。將DNA回收溶液送北京諾賽公司測(cè)序。

1．2．5kdr基因AS－PCR擴(kuò)增 以淡色庫(kù)蚊基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)5種引物（C1，C2，C3，C4，C5）對(duì)此進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為C1、C2，C3 5′CCACCGTAGTGATAGGAAATTTA 3′，C45′ACGCTGG AATACTCACG ACTG 3′，C5 5′ACGCTGGAA TACTCACGACA 3′。反應(yīng)體系含有10×Pyrobest Buffer，5μL；dNTP，4μL；基因組DNA，2 μL；C1，0．5μL；C2，0．5μL；C3，1μL；Pyrobest DNA Polymerase，0．25μL；ddH2O，35．75μL；a管中加入C4，1μL；b管中加入C4，1μL，共50μL。94℃，5min；94℃，1min，55℃，2min，72℃，2 min，40個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2．1 WHO成蚊接觸筒法 WHO抗藥性評(píng)價(jià)指標(biāo)死亡率98%～100%為敏感群體（S）死亡率80%～97%為初步抗性群體（M）死亡率80%～以下為抗性群體（R）。

2．2 單蚊基因組DNA提取 將濟(jì)南、濟(jì)寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫(kù)蚊分為敏感組（死亡）和抗性組（存活），共418只，提取單蚊基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳中在相應(yīng)的位置跑出條帶，見(jiàn)圖1。

2．3kdr基因擴(kuò)增、測(cè)序 以上述濟(jì)南、濟(jì)寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫(kù)蚊單蚊基因組DNA為模板，以C1、C2為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增kdr基因片段，得到與預(yù)期大?。?21bp）一致的基因片段，見(jiàn)圖2。

測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，不同地區(qū)淡色庫(kù)蚊成蟲(chóng)6種kdr基因型、等位基因頻率與抗藥性表型的關(guān)系如下表2。

2．4kdr基因AS－PCR擴(kuò)增 見(jiàn)圖3。

濟(jì)南、濟(jì)寧、青島和敏感的4個(gè)種群Kdr基因L1014F等位基因頻率分別為42．92%、61．27%、29．52%、18．09%，濟(jì)南、濟(jì)寧、青島和敏感的4個(gè)種群成蚊接觸筒的存活率分別為60．38%、62．75%、16．19%、1．90%，以Kdr基因L1014F等位基因頻率為x，以成蚊接觸筒的存活率為y，建立回歸方程為y＝1．536935x－23．0217，R2＝0．853049，P＜0．05。

濟(jì)南，濟(jì)寧，青島和敏感的4個(gè)種群Kdr基因L1014S因頻率分別為19.81%、21.57%、5.24%、0%，濟(jì)南、濟(jì)寧、青島和敏感的4個(gè)群成蚊接觸筒的存活率分別為60.38%、62.75%、16.19%、1.90%，以Kdr基因L1014S等部位頻率為x，以成蚊接觸筒的存活率為y，建立回歸方程為y＝2．892202x＋1．596388，R2＝0．998554，P＜0．05。

表1 不同地區(qū)淡色庫(kù)蚊成蟲(chóng)對(duì)溴氰菊酯的抗藥性Tab．1 The bioassay result of deltamethrin resistance in Culex pipiens pallens

表2 不同地區(qū)淡色庫(kù)蚊成蟲(chóng)6種kdr基因型、等位基因頻率與抗藥性表型的關(guān)系表（基因測(cè)序）Tab．2 kdr genotype and allele frequency in relationship to phenotypes determined by the deltamethrin resistance bioassay in Culex pipiens pallens populations in different regions

用基因測(cè)序的方法檢測(cè)淡色庫(kù)蚊Kdr基因發(fā)現(xiàn)，L1014F等位基因頻率和L1014S等位基因頻率與抗性水平呈正相關(guān)

2．5 2種檢測(cè)方法分析 我們選擇從濟(jì)寧采集的淡色庫(kù)蚊進(jìn)行AS－PCR的檢驗(yàn)。其中C1、C2是外引物，擴(kuò)增521bp的等位基因片段，C3和C4、C5是特異性內(nèi)引物，用以擴(kuò)增389bp（等位基因TTA）的等位基因和176bp（等位基因TTT和TCA）的等位基因。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在102份樣品中，我們獲得了64（62．75%）份樣品的結(jié)果。將 RT－PCR和AS－PCR 的 結(jié) 果 進(jìn) 行 卡 方 檢 驗(yàn)，結(jié) 果：χ2＝11．830850，P＝0．000583，P＜0．05，RT－PCR的陽(yáng)性檢出率高于AS－PCR，因此RT－PCR這種檢測(cè)方法更有效。

3 討 論

蚊蟲(chóng)的對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的擊倒抗性（knockdownresistance，kdr）又稱為靶標(biāo)抗性（targetsiteresistance），是由于神經(jīng)細(xì)胞膜para型鈉離子通道靶標(biāo)位點(diǎn)的點(diǎn)突變?cè)斐傻模?］。在科特迪瓦地區(qū)6個(gè)岡比亞按蚊自然種群中發(fā)現(xiàn)了鈉通道ⅡS6節(jié)段1014位點(diǎn)的L1014F型突變，即堿基“A”突變?yōu)椤癟”；在喀麥隆地區(qū)的岡比亞按蚊的研究中也證實(shí)kdr基因L1014F突變與抗溴氰菊酯表型呈正相關(guān)［2］。chen等［6］對(duì)南京等地的淡色庫(kù)蚊的para型鈉離子通道進(jìn)行測(cè)序，也發(fā)現(xiàn)了L1014F型突變，并與擬除蟲(chóng)菊酯抗藥性表型密切相關(guān)，與本文得出的結(jié)論一致。但在Abdalla等［7］對(duì)蘇丹地區(qū)的14只自然種群的阿拉伯按蚊的研究中未發(fā)現(xiàn)kdr基因L1014F突變與擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗藥性表型有相關(guān)性。然而研究人員認(rèn)為［8］，該研究的樣本量不足50只，所以樣本量過(guò)少，不足以體現(xiàn)基因突變與抗藥性表型間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所研究的濟(jì)南、濟(jì)寧、青島的野生及敏感種群的受試淡色庫(kù)蚊樣本量分別為64、51、74、105只，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

Kawada等［4］在岡比亞按蚊幼蟲(chóng)和阿拉伯按蚊幼蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)了L1014S型突變，Om P Singh等［9］對(duì)阿爾瓦地區(qū)的斯式按蚊進(jìn)行研究，首次在斯式按蚊中驗(yàn)證了該型突變。在對(duì)RSP－ST抗性品系的岡比亞按蚊研究中發(fā)現(xiàn)kdr基因突變型L1014S／L1014S（RR）純合子在氯氰菊酯抗藥性組群中的比例明顯增高，被認(rèn)為與氯氰菊酯抗性表型正相關(guān)［10］。很多報(bào)道證實(shí)了L1014S的突變的發(fā)生于其抗藥性相關(guān)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果即kdr基因L1014S突變與溴氰菊酯抗藥性表型呈高相關(guān)性（R2＝0．998554）一致。然而在Chen等［6］的研究中認(rèn)為淡色庫(kù)蚊L1014S突變與擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗藥性無(wú)明顯相關(guān)性，可能與她的研究中L1014S／L1014S（RR）純合子總個(gè)數(shù)為1，使L1014S突變所引起的抗藥性被忽略有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的L1014S／L1014S（RR）純合子總個(gè)數(shù)為8，含有L1014S等位基因的蚊蟲(chóng)個(gè)數(shù)為14，確保了實(shí)驗(yàn)有更高的可信性。

在AS－PCR檢測(cè)方法使用2個(gè)平行的PCR反應(yīng)體系鑒定同某1個(gè)體基因型，只在389bp處出現(xiàn)條帶，則該樣本為野生純合基因型TTA／TTA（SS）；如是突變純合子（RR）則只在176bp處只出現(xiàn)一條帶，若出現(xiàn)兩條帶為雜合子（RS），可直觀的看出每個(gè)樣品的基因型。這種技術(shù)簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，省去了純化、測(cè)序、序列對(duì)比等步驟，廣泛應(yīng)用于各種蚊蟲(chóng)的抗藥性研究的大規(guī)?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，比如中華按蚊、岡比亞按蚊等。但是AS－PCR方法常發(fā)生非特異性延伸或者引物二聚體條帶，影響了研究的陽(yáng)性檢測(cè)率和準(zhǔn)確性，因此，在進(jìn)行kdr等位基因頻率與不同自然種群抗藥性水平的研究中，RT－PCR優(yōu)于AS－PCR。

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