2株乙型腦炎病毒的E基因的克隆與序列分析＊

黃小波，袁 磊，王偉杰，賈 靜，文心田，3，曹三杰

流行性乙型腦炎是由黃病毒科乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis viruses．JEV）引起的蚊媒性人獸共患病，能夠引起人類(lèi)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變［1］。乙型腦炎主要流行于亞洲及太平洋地區(qū)，有明顯季節(jié)性，一般蚊蟲(chóng)孳生的7－9月是其發(fā)病高峰期。目前已有24個(gè)國(guó)家和地區(qū)有乙腦流行的報(bào)道，我國(guó)除新疆和青海省外，其他各省均有局部暴發(fā)或流行的報(bào)道［2］。四川省為全國(guó)乙腦高發(fā)地區(qū)，近年來(lái)發(fā)病率在2／10萬(wàn)－10／10萬(wàn)之間，疫情在全國(guó)排名靠前。四川省乙腦高發(fā)區(qū)主要分布在成都平原及川東地區(qū)，如巴中、達(dá)州、廣安、南充、遂寧以及內(nèi)江等地［3］。1957年四川首次分離出基因Ⅲ型乙腦病毒（CH－13株），2002年湯德元等在四川內(nèi)江地區(qū)分離得到1株基因Ⅲ型乙腦病毒［4］，隨后在2004年，王環(huán)宇等從四川巴中地區(qū)采集的蚊蟲(chóng)標(biāo)本中首次分離得到6株基因Ⅰ型乙腦病毒［5］。

“5．12”地震后，降雨量的增多，導(dǎo)使蚊蟲(chóng)的大量滋生，增加了乙腦傳染的幾率，再加上環(huán)境的劇烈變化可能會(huì)導(dǎo)致病毒的變異，因此做好乙腦的防控工作顯得尤為重要。本次研究對(duì)2009年分離自四川地區(qū)的2株JEV的E基因核酸序列、E基因推導(dǎo)氨基酸序列、E蛋白結(jié)構(gòu)域突變情況與基因型進(jìn)行分析研究，了解分離株的部分分子生物學(xué)特征，為四川地區(qū)流行性乙型腦炎病毒的分子生物學(xué)研究與DNA疫苗的研制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病毒株 JEV－CZ1株與JEV－NJ1株分別為本實(shí)驗(yàn)室從采集自四川崇州地區(qū)豬場(chǎng)庫(kù)蚊樣品與四川內(nèi)江地區(qū)豬流產(chǎn)死胎腦組織中分離獲得，由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1．2 菌種及主要試劑 大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19－T Simple Vector載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；TRNzol總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒；Taq DNA聚合酶；DNA MarkerⅢ購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Bio Basic公司。

1．3 標(biāo)本來(lái)源與病毒分離 2009年7月28日在四川省崇州市的3個(gè)豬場(chǎng)采集的蚊蟲(chóng)標(biāo)本，按體態(tài)特征分類(lèi)為庫(kù)蚊、按蚊和伊蚊，每類(lèi)蚊蟲(chóng)按100只／管分裝于凍存管，浸入液氮中保存。同年8月5日在四川內(nèi)江市的1個(gè)豬場(chǎng)采集的流產(chǎn)死胎腦脊液與腦組織，裝袋后用錫箔紙包裹，浸入液氮中保存。將采集的樣品研磨稀釋過(guò)濾后接種于金黃色地鼠腎細(xì)胞（BHK－21細(xì)胞）進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲得2株乙型腦炎病毒，分別命名為JEV－CZ1株與JEV－NJ1株。

1．4 病毒E基因的RT－PCR擴(kuò)增

1．4．1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank收錄的SA14－14－2、SA14、SC04－12等10株乙型腦炎病毒的E基因序列，利用DNAMAN軟件對(duì)這10株毒株的E基因進(jìn)行相似性分析，以SA14－14－2為參照確定其基因組252－2509區(qū)段為擴(kuò)增靶序列。利用Primer 5軟件合成了一對(duì)引物，下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)：上 游：5’－CCGCTCGAGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC－3’； 下 游： 5’－CCGGAATTCTTTCTTGTGATGTCAATGGCA－3’。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為2258bp。

1．4．2 病毒RNA的提取 采用TRNzol總RNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取分離株病毒液的總RNA，于－70℃保存。

1．4．3 病毒cDNA的合成 用PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用10μL體系，將病毒液總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1．4．4 E基因的擴(kuò)增 以上述cDNA為模板，采用25μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13μL，10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2（25mmol／L）2μL，dNTPs（2．5mmol／L）3μL，上游與下游引物（10pmol／L）各1μL，cDNA 模板2μL，Taq DNA 聚合酶（2．5 U／μL）0．5μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min（30個(gè)循環(huán)）；72℃補(bǔ)充延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件：80V，20min。

1．5 病毒E基因的克隆及測(cè)序 電泳檢測(cè)出現(xiàn)預(yù)計(jì)條帶后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收E基因，將回收產(chǎn)物與pMD19－T Simple Vector載體連接，再將連接產(chǎn)物傳化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH5α。利用PMD19－T載體的氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后作菌液PCR鑒定，小提質(zhì)粒，用XhoⅠ與EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1．6 病毒E基因的序列分析

1．6．1 E基因核苷酸序列同源性分析 運(yùn)用DNAMAN軟件將JEV－CZ1株與JEV－NJ1株的E基因核酸序列與GenBank收錄的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1．6．2 E基因推導(dǎo)氨基酸序列分析 運(yùn)用DNAMAN軟件推導(dǎo)出分離株E基因編碼的氨基酸序列并與GenBank收錄的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析。并對(duì)分離株E蛋白活性區(qū)（E1－E411位）3個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸差異情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

1．6．3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 采用乙腦病毒E基因分型方法，選擇乙腦病毒E基因（基因組977－2476區(qū)段），從GenBank中選取各個(gè)國(guó)家和地區(qū)包括各個(gè)基因型的34株參考毒株，另選1株墨累谷腦炎病毒（MVE）作為外群，用ClustalX軟件進(jìn)行堿基配對(duì)，種系分析運(yùn)用MEGA4．1軟件的Neighbor（鄰系接合法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以確定分離株的基因型別。

2 結(jié) 果

2．1 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用RT－PCR方法擴(kuò)增出病毒E基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，與DNA MarkerⅢ比較，大小在2 000bp和3 000bp之間，與預(yù)期片段大小相符。

2．2 E基因的克隆與鑒定結(jié)果 將分離株E基因重組質(zhì)粒用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，分別得到大小約為2 200bp與2 700bp 2條片段，與目的基因和載體片段大小相符，證明對(duì)分離株E基因的克隆成功。

2．3 E基因的同源性分析結(jié)果 將JEV－CZ1株與JEV－NJ1株的E基因核酸序列同GenBank上發(fā)表的JEV參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明：JEV－CZ1株核酸序列與SA14－14－2（減毒活疫苗株）、SA－14（中國(guó)山西）、SC04－12（中國(guó)四川）、SC04－16（中國(guó)四川）、HN04－11（中國(guó)河南）、HN04－40（中國(guó)河南）、VN22（越南）株相應(yīng)序列的同源性分別為87．6%，87．7%，98．5%，98．9%，98．4%，97．9%，98．9%，JEV－NJ1株核酸序列與上述7株病毒相應(yīng)序列的同源性分別為99．6%，99．7%，91．1%，91．2%，91．0%，90．8%，91．1%（表1）。

表1 不同毒株E基因核酸同源性比對(duì)結(jié)果Tab．1 Homology comparison of E gene nucleotide sequences among different strains

2．4 E基因推導(dǎo)氨基酸序列分析結(jié)果

2．4．1 氨基酸序列同源性分析結(jié)果 JEV－CZ1株E基 因 推 導(dǎo) 的 氨 基 酸 序 列 與 SA14－14－2、SA－14、SC04－12、SC04－16、HN04－11、HN04－40、VN22株相應(yīng)序列的同源性分別為97．2%，97．3%，99．2%，99．2%，99．1%，98．1%，99．2%。JEV－NJ1株 E基因推導(dǎo)的氨基酸序列與上述7株病毒相應(yīng)序列的同源 性 分 別 為 99．2%，99．4%，97．5%，97．5%，97．3%，96．4%，97．5%（表2）。

2．4．2 E蛋白活性區(qū)氨基酸差異分析 JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2株在E蛋白3個(gè)結(jié)構(gòu)域中（DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ）有15個(gè)氨基酸的差異；JEVNJ1株有3處差異（表3）。

2．5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果 乙型腦炎病毒E基因分型結(jié)果顯示，所有乙腦病毒分布于5個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)群，本次研究的JEV－CZ1株屬于基因Ⅰ型，并與2004年分離自四川的毒株與越南分離的毒株遺傳關(guān)系較近，JEV－NJ1屬于基因Ⅲ型，與疫苗株SA14－14－2株以及以往四川與上海分離的毒株遺傳關(guān)系較近（圖1）。

3 討 論

E蛋白是病毒的包膜蛋白，為主要蛋白，有病毒的抗原決定簇。其分子量為53kD，由500個(gè)氨基酸殘基組成。由E蛋白形成的表面抗原決定簇具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗體結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊，與誘導(dǎo)宿主機(jī)體的免疫應(yīng)答密切相關(guān)［6］。JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2的E基因核酸序列同源性為87．6%，氨基酸序列同源性為97．2%，核酸同源性較低，但該區(qū)段的核酸差異一般發(fā)生于氨基酸密碼子的第3位，即突變的位點(diǎn)多以沉默突變的形式存在；而JEV－NJ1株與疫苗株核酸與氨基酸同源性為均在99%以上。SA14－14－2株與JEV－CZ1株屬于不同基因型，因此關(guān)于SA14－14－2株減毒疫苗對(duì)Ⅰ型乙腦病毒的保護(hù)力如何應(yīng)進(jìn)一步研究。

表2 不同毒株E基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果Tab．2 Homology comparison of E protein amino acid sequences among different strains

圖1 E基因序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig．1 Phylogenetic tree analysis on E gene nucleotide sequence

通過(guò)對(duì)E蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，發(fā)現(xiàn)JEV－CZ1株與疫苗株SA14－14－2在3個(gè)結(jié)構(gòu)域中有15個(gè)氨基酸差異；而JEV－NJ1株只有3處差異；有學(xué)者的研究表明E304和E335兩個(gè)Cys所形成的二硫鍵是抗原抗體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)［7］，該兩分離株在這兩個(gè)位點(diǎn)的Cys都沒(méi)有發(fā)生變異。研究表明E60～E68的氨基酸序列 Cys－Tyr－His－Ala－Ser－Val－Thr－Asp－Thr對(duì)病毒引起細(xì)胞免疫至關(guān)重要［8］，JEV－CZ1株在E67位的Asp被替換成Glu，而JEV－NJ1株在這一區(qū)段非常保守。有學(xué)者在對(duì)乙腦減毒機(jī)理進(jìn)行研究時(shí)認(rèn)為E138位的Glu替換為L(zhǎng)ys后毒力會(huì)有較明顯降低［9］。本次研究發(fā)現(xiàn)JEV－NJ1株與疫苗株SA14－14－2的E138位氨基酸均為L(zhǎng)ys，而JEV－CZ1株則為Glu。有學(xué)者研究證明針對(duì)結(jié)構(gòu)域Ⅲ的抗體在對(duì)JEV中和反應(yīng)中起著重要作用，尤其是在E337－345、E377－382、E397－403 3個(gè)區(qū)域內(nèi)發(fā)生變異會(huì)導(dǎo)致抗原性的改變，甚至影響抗原與中和抗體的結(jié)合反應(yīng)［10］，本次研究通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)新分離的兩株JEV與疫苗株在這3個(gè)區(qū)域上完全一致。

表3 E蛋白活性區(qū)不同結(jié)構(gòu)域的氨基酸差異Tab．3 Amino acid substitutions in different domains of E protein

1992年 WR Chen等［11］首先依據(jù)乙腦病毒PrM／C基因區(qū)段（456～695）的核酸序列將乙腦病毒劃分為4個(gè)基因型。英國(guó)Solomon等研究認(rèn)為乙腦病毒可能起源于印尼－馬來(lái)群島，該地區(qū)包括乙腦病毒所有基因型［12］，乙腦病毒在向其他地區(qū)傳播過(guò)程中受多因素協(xié)同作用，有較強(qiáng)的地域性。我國(guó)自1949年在北京首次分離到乙腦病毒，此后在其它中國(guó)地區(qū)也相繼分離到毒株，累計(jì)已有60余年歷史，Wang［13］等對(duì)中國(guó)自1949－2005年以來(lái)分離的乙腦毒株的研究顯示中國(guó)分離的乙腦病毒以基因Ⅲ型為主，偶有基因Ⅰ型。2001年在上海我國(guó)首次分離得到基因Ⅰ型乙腦病毒，隨后在遼寧、廣西、甘肅、河南和四川等省份也分離得到了基因Ⅰ型乙腦病毒［14－15］。本次研究為了避免用較短的核苷酸序列進(jìn)行分析可能導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確，而采用E基因（1 500bp）進(jìn)行分型，結(jié)果顯示2009年從四川崇州市與內(nèi)江市的豬場(chǎng)蚊子與流產(chǎn)死胎腦組織中分離到的JEV－CZ1株和JEV－NJ1株分別屬于基因Ⅰ型和基因Ⅲ型。研究還發(fā)現(xiàn)JEV－CZ1株與2004年分離自 四 川 的 毒 株 SC04－16、SC04－12 和 越 南 分 離 株VN22遺傳關(guān)系較近，JEV－NJ1株與疫苗株SA14－14－2以及以往四川與上海分離的毒株遺傳關(guān)系較近，基本符合乙腦病毒具有較強(qiáng)地域性的特征。本次研究結(jié)果對(duì)深入研究四川乙腦病毒的分子生物學(xué)特征、DNA疫苗的研制以及建立乙型腦炎基因數(shù)據(jù)庫(kù)具有重要意義。

［1］殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)［M］．北京：科學(xué)出版社，1997：1226．

［2］Solomon T．Recent advances in Japanese encephalitis［J］．Journal of Neurovirology，2003，9（2）：274－283．

［3］張佳珂，林世華，陳丹林，等．2006－2007年四川省流行性乙型腦炎臨床病例血清學(xué)分析［J］．預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2008，24（12）：978－980．

［4］湯德元，郭萬(wàn)柱，徐志文，等．乙型腦炎病毒的分離與鑒定［J］．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)．2004，22（1）：70－74．

［5］王環(huán)宇，張佳珂，付士紅，等．四川省分離的基因1型乙型腦炎病毒分子特征分析［J］．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2009，29（9）：816－821．

［6］王祥，陳煥春．JEV分子生物學(xué)與新型疫苗研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展雜志，2008，22（3）：5－9．

［7］Mason PW，Dalrymple JM，Gentry MK，et al．Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein［J］．J Gen Virol，1989，70（8）：2037－2049．

［8］Takada K，Masaki H，Konishi E，et al．Definition of an epitope on Japanese encephalitis virus（JEV）envelope protein recognized by JEV－specific murine CD＋8cytotoxic T lymphocytes［J］．Arch Virol，2000，145（3）：523－534．

［9］Ni H，Chang GJ，Xie H，et al．Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild－type Japanese encephalitis virus strain SA14［J］．J Gen Virol，1995，76（2）：409－413．

［10］Wu SC，Lin CW．Neutralizing peptide ligands selected from phage－displayed libraries mimic the conformational epitope on domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein［J］．Virus Res，2001，76（1）：59－69．

［11］Chen WR，Rico－Hesse R，Tesh RB．A new genotype of Japanese encephalitis virus from Indonesia［J］．Am J Trop Med Hyg，1992，47（1）：61－69．

［12］Solomon TH，Beasley DC，Ekkelenkamp M．Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in Southeast Asia［J］．J Virol，2003，77（5）：3091－3098．

［13］Wang HY，Takasaki T，F(xiàn)u SH，et al．Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China［J］．J Gen Virol，2007，88（3）：885－894．

［14］王環(huán)宇，付士紅，李曉宇，等．中國(guó)首次分離到基因Ⅰ型乙型腦炎病毒［J］．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24（11）：843－849．

［15］王俊文，付士紅，王環(huán)宇，等．遼寧省乙腦病毒的分離與鑒定［J］．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20（1）：61－65．