狂犬病病毒減毒株的研究及應用進展

鄒 劍，俞永新

狂犬病是由狂犬病病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的人獸共患病，全世界每年造成的死亡人數(shù)估計為55 000（90%CI：24 500－90 800），主要集中在亞洲和非洲的發(fā)展中國家，其中約56%發(fā)生在亞洲，44%發(fā)生在非洲［1］。目前印度是全世界狂犬病最流行的國家，每年約有20 000人死于狂犬病，大約96%的人狂犬病病例都是由犬咬傷所致，這其中由寵物犬咬傷所占的比例為11%，其余大多是流浪犬所致［2］。我國也是狂犬病嚴重流行的國家之一，發(fā)病人數(shù)僅次于印度居世界第2位。2007年全國報告死亡病例數(shù)高達3 300人，2008和2009年狂犬病死亡人數(shù)都超過2 400人，一直位列我國各類傳染病報告死亡數(shù)的前3位［3］。上世紀80、90年代開始歐美多個國家使用減毒活疫苗或重組活疫苗用于狂犬病毒宿主的免疫計劃，使得野生動物狂犬病的數(shù)量大大降低，間接地降低了由野生動物傳染至家養(yǎng)動物及人的可能性，產(chǎn)生了良好的社會經(jīng)濟效應。我國大部分城市地區(qū)都有針對寵物犬、貓的注射免疫接種計劃，但農(nóng)村地區(qū)散養(yǎng)的犬、貓數(shù)量大、分布廣，注射滅活疫苗受到操作難度大、接種次數(shù)多、效期短、需要組織大量人力，還有咬傷工作人員的危險等因素的限制。而由狂犬病病毒減毒株制備的口服活疫苗不僅能夠誘導更強的固有及適應性免疫反應，減少接種次數(shù)和劑量，而且具有疫苗成本低，操作方便，利于推廣的很多優(yōu)點。因此WHO推薦使用減毒活疫苗用于野生動物及流浪犬只狂犬病的防治。鑒于我國狂犬病防治的嚴峻形勢（犬群數(shù)量大，約7 500萬只，農(nóng)村地區(qū)犬只免疫率僅為10%～20%，貓則幾乎沒有免疫，野生動物狂犬病的防治還存在空白等［3］），有必要研制狂犬病毒口服活疫苗。

1 現(xiàn)有狂犬病病毒減毒株的篩選和應用

1．1 現(xiàn)有狂犬病病毒減毒株的篩選 國外最早于上世紀60年代開始研制狂犬病毒減毒口服活疫苗，主要用于野生動物狂犬病的防治，陸續(xù)篩選出了SAD，ERA，SAD－Bern，SAD VA1，SAD B19，SAD P5／88，Vnukovo－32，SAG1，SAG2 減 毒 株。所有這些減毒株都來源于1935年從美國亞拉巴馬州一只死亡的犬腦內(nèi)分離的毒種［4］，經(jīng)鼠腦、地鼠腎細胞、雞胚等傳代減毒后成為固定毒，命名為SAD。SAD再經(jīng)Evelyn，Rokitniki，Abelseth 3位科學家在多種細胞系傳代適應減毒，為紀念3位科學家將該毒株命名為ERA株［5］。70年代初瑞士科學家從美國疾病控制中心獲得該毒株，經(jīng)BHK－21細胞進一步適應后得到SAD－Bern減毒株。在歐洲，SADBern減毒株是第一個SAD毒種來源的成功應用于狐貍狂犬病防治田間試驗的毒種［6］。在SAD－Bern減毒株的基礎上，德國科學家將SAD－Bern毒種繼續(xù)在BHK－21細胞上克隆篩選獲得了對溫度敏感且對嚙齒動物低毒力的SAD B19株，以及其它突變株SAD P5／88株；另外將SAD－Bern株在BSR細胞上突變獲得SAD VA1株［7］；前蘇聯(lián)也用SAD來源的毒種獲得了對溫度敏感的Vnukovo－32減毒株，以上幾種與SAD有關的減毒株對成年小白鼠（腦內(nèi)、肌肉、口服）和其它嚙齒動物都有一定致病性，但對大型肉食動物口服后的安全性較好。1989年Tuffereau等發(fā)現(xiàn)糖蛋白第333位精氨酸是CVS和ERA株毒力的關鍵位點［8］。鑒于以上發(fā)現(xiàn)，法國科學家用狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體對SAD－Bern株加壓篩選得到SAG1株。SAG1株編碼G蛋白第333位氨基酸的密碼子發(fā)生AGA到AGC的突變，相應氨基酸由精氨酸變?yōu)榻z氨酸（Arg333→Ser333）；同理在SAD－Bern株的基礎上經(jīng)過G蛋白單克隆抗體的兩步加壓篩選，第1次篩選得到SK株，G蛋白第333位氨基酸密碼子由AGA突變?yōu)锳AA，編碼的氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼幔ˋrg333→Lysr333），再對SK株按同法篩選得到SAG2株，其G蛋白第333位氨基酸密碼子由AAA突變?yōu)镚AA，編碼的氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝彼幔ˋrg333→Glu333），因此SAG2不僅突變了原代SAD－Bern株G蛋白第333位精氨酸的關鍵毒力位點，而且密碼子發(fā)生了兩個位點的突變（AGA→GAA），相比于SAG1的單位點突變（AGA→AGC），進一步降低了回復突變?yōu)榫彼岚l(fā)生毒力回復的可能性［9－10］（圖1）。

圖1 現(xiàn)在狂犬病毒減毒株的篩選歷史SAD：Street Alabama Dufferin；ERA：Evelyn Rokitniki Abelseth；AGA：SAD－Bern G蛋白第333位精氨酸密碼子；AAA：SAG1G蛋白第333位絲氨酸密碼子；GAA·SAG·G蛋白第33碼位谷氨酸密碼子

我國也于上世紀70、80年代引進國外LEPFlury株和ERA株生產(chǎn)弱毒獸用疫苗，用于牛、馬、家犬等牲畜的注射免疫。另外原中國藥品生物制品檢定所（現(xiàn)中國食品藥品檢定研究院）將我國人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒種CTN－1株以及CTN－M株口服拌喂家犬，在對上萬只家犬進行的田間試驗表明弱毒活疫苗對犬安全并且能有效降低家犬狂犬病的發(fā)生［11－12］。軍事醫(yī)學科學院侯世寬等人還以SAD B19株為親本株通過噬斑挑選出中等大小的克隆株SRV9株，經(jīng)初步動物實驗表明具有良好的免疫原性和安全性［13］。

1．2 現(xiàn)有狂犬病病毒減毒株的安全性評價 考慮到減毒株的殘余毒力，以及毒力回復突變的可能性，WHO專家咨詢會對口服減毒株的安全性評價及監(jiān)測做出了詳細規(guī)定，并制定了《狂犬病口服疫苗研制及田間試驗指導原則》，主要包括疫苗對靶動物和非靶動物的致病力以及動物攝食后病毒在動物體內(nèi)的分布及唾液的排毒情況等。要求對候選疫苗株在實驗室條件下以10倍于田間試驗的劑量通過口服或肌肉注射的方式，對10周齡以下的幼犬應不致病。另外應在靶動物口服疫苗后的第1d開始收集唾液標本，至少連續(xù)7d，以驗證唾液是否排毒［14］。以SAD B19減毒株為例，Neubert等用SAD B19減毒株經(jīng)不同途徑接種包括狗、貓、水貂、雪貂、狒狒、雞等在內(nèi)的多種靶動物和非靶動物后都未發(fā)現(xiàn)SAD B19引起的狂犬病，少數(shù)嚙齒類動物出現(xiàn)致病性（大鼠致病率5．8%，小鼠致病率2%）［15］。Vos等使用商業(yè)化的SAD B19減毒活疫苗誘餌（每個誘餌含1×107．9TCID50／mL）口服免疫臭鼬后未發(fā)現(xiàn)病毒誘發(fā)的狂犬病，1d后收集唾液和鼻腔分泌物未發(fā)現(xiàn)殘余病毒［16］。從實際應用的監(jiān)測結果來看，德國、奧地利在投放上千萬例的SAD B19減毒活疫苗誘餌后只確證7例由該減毒株引起的野生動物狂犬病例（德國6例，奧地利1例）［17］。

由于減毒株存在回復突變的風險，因此驗證減毒株的遺傳穩(wěn)定性也是安全性評價的重要方面，Beckert等將SAD B19毒株在狐貍和小鼠腦內(nèi)分別連續(xù)傳4代和10代，在狐貍傳代過程中第9240位核苷酸（L基因上）發(fā)生A到G的突變，編碼的氨基酸由Gln變?yōu)?Arg，但未發(fā)現(xiàn)毒株毒力的改變［18］。最近Austin等人運用分子進化遺傳學的方法對SAD B19與狂犬病病毒街毒株的種系發(fā)生分析顯示，街毒株在編碼區(qū)及非編碼區(qū)都存在大量的非同義替換，凈化選擇（負向選擇）遠大于SAD B19毒株。該研究從進化的分子機制上解釋了SAD B19減毒株的遺傳穩(wěn)定性［19］。除SAD B19減毒株外，SAG1、SAG2減毒株由于其第333位精氨酸毒力的關鍵位點發(fā)生了改變，顯示了更低的殘余毒力，對成年小鼠和其他野生嚙齒動物經(jīng)口服、肌肉、腦內(nèi)途徑接種均不致病，多項研究表明對多種哺乳類動物，包括大多數(shù)狂犬病毒的存儲宿主沒有致病性［20］。特別是SAG2的遺傳穩(wěn)定性更高，在乳鼠腦內(nèi)傳代后未發(fā)現(xiàn)毒力的回復突變，已被WHO推薦作為野生動物和犬的口服減毒活疫苗生產(chǎn)用毒種［1］。

1．3 現(xiàn)有減毒口服活疫苗的應用效果 在歐洲由SAD B19、SAD P5／88、SAG1、SAG2減毒株制成的口服獸用活疫苗被廣泛的應用于野生動物狂犬病的防治中［21］。從1983起，德國和奧地利共投放了超過9 700萬例的SAD B19、SAD P5／88減毒活疫苗誘餌。在1982－1992間，法國也投放了超過60萬例的SAD B19活疫苗誘餌［22］。德國和奧地利分別于1950年和1966年出現(xiàn)首例狂犬病例，1983年和1990年到達頂峰，分別達到了10 484例和2 514例，大面積使用減毒活疫苗誘餌后德國和奧地利的狂犬病例大幅下降（2003年德國發(fā)現(xiàn)23例，奧地利僅1例）［17］。SAG1，SAG2減毒活疫苗誘餌主要在法國、瑞士、比利時、盧森堡、愛沙尼亞等國家和地區(qū)使用。從法國、愛沙尼亞的使用情況來看，法國最早從1990開始使用SAG1，SAG2減毒活疫苗誘餌，使用面積覆蓋了主要發(fā)生狂犬病的區(qū)域（約140 000 km2），免疫之后，法國動物狂犬病例大幅下降，到1998年只監(jiān)測到2例狐貍和貓的狂犬?。?2］。愛沙尼亞從2004年開始采用SAG2減毒活疫苗誘餌用于野生動物狂犬病的防治計劃，最初使用范圍局限在零星的島嶼和北部野生動物狂犬病高發(fā)區(qū)，后推廣到全境，通過口服免疫計劃，愛沙尼亞的野生動物狂犬病例數(shù)也由2003年最高峰時的841例下降到2006年的114例［23］。目前，通過口服減毒活疫苗的免疫計劃，比利時、盧森堡、法國、意大利、瑞士、芬蘭、荷蘭已基本消滅陸生動物狂犬病。

2 新型狂犬病毒減毒株

早在1994年，Schnell等就已成功拯救出了狂犬病病毒［24］，近年來隨著該技術的日益成熟，基于反向遺傳學的基因操作被廣泛的應用于狂犬病毒的分子生物學研究當中，其中包括毒力的研究以及新型減毒活疫苗、嵌合病毒、病毒載體的研究。新型減毒活疫苗的研究一般以現(xiàn)有的減毒株為基礎，例如以SAD B19的cDNA克隆拯救得到的SPBN系列基因工程株，從RC－HL拯救得到的R（NPMGGL）株和以 HEP－Flury株為基礎構建 的 def－P HEP－Flury株，通常采取以下構建策略：①在分子水平上定向改造已知的毒力位點以進一步降低原代減毒株的殘余毒力；②在G－L基因之間含423個堿基的偽基因 Ψ區(qū)插入外源基因，增強免疫原性，降低毒力；③直接構建缺陷株，以獲得更安全的減毒株。具體可分為以下四類。

2．1 突變毒力相關位點 SPBN株由SAD B19拯救得到，SAD B19對小鼠腦內(nèi)注射有部分殘余毒力，已知G蛋白333位精氨酸是該毒株毒力的關鍵位點［8］。2002年，F(xiàn)aber等將SPBN 株 G蛋白第333位精氨酸定點突變?yōu)楣劝彼幔ˋrg333→Glu333），得到SPBNGA株（突變后的G蛋白記做GA），該株對成年小鼠腦內(nèi)注射不致?。?5］。但2005年Faber等發(fā)現(xiàn)SPBNGA株在新生乳鼠腦內(nèi)傳5代后發(fā)生毒力回復，對成年小鼠腦內(nèi)注射致病，與原代毒株比較后未發(fā)現(xiàn)G蛋白第333位氨基酸未發(fā)生回復突變，但G基因第637位至639位密碼子由ATT突變?yōu)锳AG或AAA，導致G蛋白第194位氨基酸由天門冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔ˋsn194→Lys194），該突變株命名為SPBNGA－K株。Faber等將SPBNGA－K株G蛋白第194位氨基酸定點突變?yōu)榻z氨酸（Lys194→Ser194）后重新得到對小鼠腦內(nèi)注射無致病力的SPBNGAS株（突變后的GA蛋白記做GAS），且毒力更穩(wěn)定，經(jīng)乳鼠腦內(nèi)傳5代后未出現(xiàn)毒力回復［26］。

2．2 雙聯(lián)或三聯(lián)突變G基因的減毒株 大量的研究表明G蛋白是誘導產(chǎn)生狂犬病毒中和抗體最重要的保護性抗原［27－28］，2002年，F(xiàn)aber等在 SPBNGA株基礎上額外插入GA基因得到SPBNGA－GA株，SPBNGA－GA株同SPBNGA株在BSR細胞的增殖滴度相近，但SPBNGA－GA G蛋白的表達量約為SPBNGA的1．6倍。通過比較神經(jīng)細胞線粒體的呼吸強度和Caspase 3凋亡途徑的活性，表明SPBNGA－GA比SPBNGA更能誘導神經(jīng)細胞的凋亡，免疫小鼠后，用快速熒光灶抑制試驗測得在低劑量條件下（103FFU和102FFU）SPBNGA－GA產(chǎn)生的中和抗體效價更高，兩周后用100LD50的CVS攻擊，小鼠保護率同產(chǎn)生的抗體效價成正比，SPBNGA－GA組更有效地抵抗病毒的攻擊［25］。2009年Faber等在SPBNGAS株基礎上［23］，同時將2個到3個突變的G蛋白基因插入到SPBNGAS中分別得到 SPBAANGAS－GAS 和 SPBAANGAS－GASGAS株，另外插入兩個起始密碼子被打亂的GAS基因 到 SPBNGAS中 得 到 SPBAANGAS－GAS（－）－GAS（－）株作為對照。在細胞內(nèi)培養(yǎng)2d后SPBAANGAS－GAS－GAS株可以達到107FFU／mL的感染滴度，對乳鼠腦內(nèi)注射（103TCIU）后發(fā)現(xiàn)，只有SPBAANGAS－GAS－GAS對5日齡和10日齡乳鼠完全無致病力。將SPBAANGAS－GAS－GAS株（107FFU）和高致病力 DOG4RV 株（100IC－LD50）混合注射到小鼠腦內(nèi)，小鼠100%存活。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)SPBAANGAS－GAS－GAS株誘導小鼠血腦屏障通透性增強，能募集更多的淋巴細胞進入到小腦和大腦皮層。預先用106FFU高致病力的DOG4毒株肌內(nèi)感染，再用107FFU 的SPBAANGAS－GASGAS減毒株在感染48，72，96，120h后腦內(nèi)注射，對小鼠都有100%的保護力；改用108FFU的SPBAANGAS－GAS－GAS減毒株在感染 DOG4毒株16，24，48，72h后肌內(nèi)注射，對小鼠的保護力分別能達到 90%，55%，40%，30%。SPBAANGASGAS－GAS株對乳鼠的不致病性和良好的免疫原性甚至對暴露后免疫的部分療效使得該減毒株有望用于人的暴露前和暴露后治療［29］。

同理，2006年Hosokawa等利用RC－HL株的反向遺傳學系統(tǒng)在RC－HL株的基礎上構建成功了含兩個G蛋白的R（NPMGGL）株，隨后的一系列研究顯示R（NPMGGL）株同RC－HL株在細胞內(nèi)的增殖情況相似，但G蛋白的表達量是RC－HL株的1．5倍，電鏡下R（NPMGGL）的病毒顆粒也比RC－HL的顆粒大，滅活免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體滴度也更高［30］。

2．3 插入增強免疫反應的外源基因 由于凋亡細胞能促進樹突狀細胞的成熟和抗原的呈遞并能釋放細胞因子誘導限制性T細胞的活性，刺激產(chǎn)生更強的免疫反應，2001年，Pulmanausahakul等將促進細胞凋亡的細胞色素c（Cyto c）基因插入SPBN株G和L基因的非編碼序列之間，構建了［SPBN－Cyto c（＋）］株，該株在體外能大量表達細胞色素c，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)無論是誘導產(chǎn)生的的中和抗體滴度還是對病毒攻擊的保護力［SPBN－Cyto c（＋）］株都優(yōu)于［SPBN－Cyto c（－）］株，有效保護劑量比后者低20倍［31］。已知TNF－α在抗細菌和抗病毒感染中發(fā)揮重要作用［32］，2005年，F(xiàn)aber等還構建了能表達可溶性 TNF－α 的 ［SPBN－TNF－（＋ ）］株 和 膜 結 合TNF－α的SPBN－TNF－（MEM）株以及不表達 TNF－α的［SPBN－TNF－（－）］株，三株在神經(jīng)細胞的增殖能力相近，最終都能達到107FFU／ml，以106FFU的感染劑量鼻腔內(nèi)免疫TNF－α基因缺陷型小鼠，發(fā)現(xiàn)只有［SPBN－TNF－（＋）］對小鼠完全不致病，組織切片染色后發(fā)現(xiàn)［SPBN－TNF－（＋）］株多集中在海馬回，［SPBN－TNF－（－）］主要分布在大腦皮層，SPBNTNF－（MEM）在海馬回和大腦皮層平均分布，［SPBN－TNF－（＋）］感染的小鼠柔腦膜和大腦實質(zhì)的血管周圍能明顯的檢測到以白細胞浸潤和T細胞募集為特征的炎癥反應，這些發(fā)現(xiàn)都提示TNF－α的表達可能直接抑制病毒在神經(jīng)細胞的復制和傳播，并且增強了血腦屏障的通透性，有助于淋巴細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)清除狂犬病毒的感染［33］。趨化因子是一類誘導炎癥反應的重要細胞因子，2010年Ling Zhao等構建了表達趨化因子 MIP－1α（CCL3）的重組病毒rHEP－MIP1α株，通過比較其它重組病毒株 （rHEP－MIP1α（－），rHEP，rHEP－IP10）發(fā) 現(xiàn)MIP－1α的表達有助于在免疫部位更有效的募集樹突狀細胞，增強對抗原的呈遞作用，刺激B淋巴細胞產(chǎn)生更高滴度的狂犬病毒中和抗體［34］。

2．4 基因缺陷型減毒株的構建 基因缺陷型病毒不能單獨完成自身復制，因此有更好的安全性。構建基因缺陷型病毒也成為研制新型狂犬病毒減毒活疫苗的重要策略之一。2004年Youko Shoji等以HEP－Flury弱毒株為基礎構建了缺失整個P基因的def－P HEP－Flury缺陷株，通過 NIH 法以10×106FFU的劑量免疫小鼠，能100%抵抗CVS毒株的攻擊［35］。2005年，Ito N 等利用RC－HL株的反向遺傳學系統(tǒng)構建成功缺失M基因的缺陷株RCHLΔM株，肌內(nèi)免疫和鼻腔免疫都能有效的誘導中和抗體，但增殖效率較低，最多只能達到6．1×105FFU／ml［36］。同理，2008年Jonathan等也構建了缺失狂犬病毒P基因的缺陷株SPBN－ΔP株，另外還在SPBN－ΔP株的基礎上額外插入1個G蛋白基因得到SPBN－ΔP－RVG株，小鼠肌內(nèi)注射三個劑量（105FFU，104FFU，103FFU）的活疫苗，SPBN－ΔP株誘導的抗體中IgG1a和IgG2a兩個亞型的量相當，SPBN－ΔP－RVG誘導產(chǎn)生IgG2a亞型為主的抗體，而IgG2a被認為能夠提供更好的保護力。用缺陷型病毒對免疫缺陷小鼠腓腸肌注射后小鼠不致病，在脊髓和大腦也檢查不到缺陷株的 RNA［37－38］。這些缺陷株的共同特點是病毒只在表達外源P蛋白或M蛋白的細胞系中才能增殖，對乳鼠、免疫缺陷鼠不致病，但往往增殖滴度較低，由于缺乏自我復制的能力以及缺失部分結構蛋白，免疫原性不如完整病毒。

3 結 語

目前WHO推薦使用殘余毒力低的SAG2減毒活疫苗和重組痘病毒載體活疫苗（VRG）用于狂犬病的口服免疫計劃，從歐美等多個國家的使用情況來看，減毒或重組狂犬病毒口服活疫苗在控制和消滅陸生動物狂犬病方面取得了巨大成功［39－40］，并大大節(jié)約了狂犬病防治成本，Shwiff等對德克薩斯州1995年至2006年家養(yǎng)犬和郊狼的口服狂犬病活疫苗免疫計劃支出和收益研究顯示，按不同的暴露后治療的比例來計算，口服狂犬病活疫苗免疫計劃的收益大約為成本支出的3至13倍（支出26 358 221美元，收益89 000 000美元至346 000 000美元，相當于口服免疫計劃每花費1美元可節(jié)約3．38美元至13．12美元）。減少的支出主要來自于減少的暴露后治療和對動物狂犬病的檢測費用上［41］。按我國現(xiàn)有人口規(guī)模和人口比例估算，所有的狂犬病暴露后預防均得到處理，每年約需245億元（農(nóng)村地區(qū)約170億元、城市地區(qū)約75億元）［3］?？袢∫殉蔀槲覈残l(wèi)生安全防控的巨大負擔。

近年來新型減毒株的設計為我們開發(fā)更高效、安全的口服活疫苗提供了新的思路，并顯示出一定程度的實際應用的前景，例如，2004年Dietzschold等證明了SPBNGA和SPBNGA－GA株具有良好的熱穩(wěn)定性和在生物反應器中培養(yǎng)的高增殖滴度［42］。2005年Amy等將已構建的新型狂犬病毒SPBNCyto c株，SPBNGA株，SPBNGAGA株和SN10－333株（從SAD B19株通過定點突變第333位精氨酸突變?yōu)楣劝彼岬玫剑?，同已?jīng)商業(yè)化應用的VRG（重組痘病毒載體活疫苗）比較，在相同的病毒滴度下（108TCID50／mL）通過口服免疫的方式測定這幾種疫苗對犬的保護力，免疫保護力相當，能100%的保護街毒株的攻擊，且沒有活疫苗誘發(fā)的狂犬病［43］。特別是新的 SPBAANGAS－GAS－GAS減毒株具有毒力高度減弱（對乳鼠腦內(nèi)接種不致病），免疫保護力良好（暴露后接種1針即可達到有效保護）的特性，因此具備研制成一種可用于人類狂犬病暴露后治療的減毒活疫苗的前景?？偟脕碚f，針對我國目前狂犬病防控的嚴峻形勢，研制高效、安全適合應用于流浪犬和野生動物的口服減毒活疫苗具有重大現(xiàn)實意義［44］，爭取在2020年之前實現(xiàn) WHO計劃的基本控制狂犬病的目標。

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