耐復(fù)方新諾明香港海鷗型菌中Ⅰ類整合子、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2）的檢測(cè)＊

陳 冰，馮嘉麗，李美霞，朱江峰，魏耀紅，張 歐，康 燕，俞守義，陳 清，胡 靜

耐復(fù)方新諾明香港海鷗型菌中Ⅰ類整合子、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2）的檢測(cè)＊

陳 冰1，馮嘉麗1，李美霞2，朱江峰1，魏耀紅2，張 歐1，康 燕2，俞守義1，陳 清1，胡 靜1

目的了解香港海鷗型菌淡水魚與蛙來(lái)源分離株磺胺類耐藥性以及Ⅰ類整合子介導(dǎo)耐藥的情況。方法采用K－B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)香港海鷗菌耐復(fù)方新諾明藥物菌株，PCR方法擴(kuò)增耐藥菌株sul1、sul2和Ⅰ類整合子基因。結(jié)果128株香港海鷗菌中共有20株耐復(fù)方新諾明藥物，耐藥率15．6%；20株耐藥菌株中sul1陽(yáng)性率90%，sul2陽(yáng)性率50%，Ⅰ類整合子攜帶率80%。結(jié)論淡水魚與蛙來(lái)源香港海鷗型菌菌耐磺胺的機(jī)制可能與Ⅰ類整合子、sul1、sul2基因有關(guān)。

香港海鷗型菌；Ⅰ類整合子；磺胺類耐藥基因

香港海鷗菌（Laribacter hongkongensis，LH）最早為2001年香港大學(xué)學(xué)者在一位肝硬化病人的胸腔積膿中分離得到，經(jīng)鑒定為變形菌門、β－亞綱奈瑟氏菌科的新菌屬［1］。2004年，香港學(xué)者 Woo等進(jìn)行的一項(xiàng)多中心病例對(duì)照研究中表明［2］，香港海鷗菌與旅行者腹瀉和社區(qū)獲得性胃腸炎有關(guān)。目前，香港海鷗菌在香港地區(qū)、中國(guó)大陸多省份、瑞士、日本、非洲等多地區(qū)均有檢出［2－4］，香港海鷗菌主要分布在某些種類的淡水產(chǎn)品中。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，香港海鷗菌存在對(duì)多種抗生素都存在耐藥性［1，5－6］。鑒于復(fù)方新諾明是臨床治療消化道感染的抗菌藥物之一，為了解淡水產(chǎn)品分離的香港海鷗菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥及磺胺類耐藥基因攜帶情況，我們對(duì)廣州市部分淡水魚與蛙分離香港海鷗菌復(fù)方新諾明耐藥性及磺胺類耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1．1 菌株 香港海鷗型菌株由本實(shí)驗(yàn)室馮嘉麗等［5］于2008年11月－2009年4月，自廣州市淡水產(chǎn)品的腸道中分離獲得香港海鷗菌128株，其中魚源株39株（30．46%），蛙源株89株（69．53%）。

1．2 試劑來(lái)源 K－B藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xiod公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司，引物合成自英偉創(chuàng)津公司，PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生公司等。

1．3 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用K－B紙片擴(kuò)散法，金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）作為質(zhì)控菌，判定按照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）腸桿菌科判斷標(biāo)準(zhǔn)（2008年版）執(zhí)行?？股丶埰ǎ侯^孢菌素類類、青霉素類、氨基糖甙類、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等。

1．4 基因檢測(cè) 挑選出對(duì)復(fù)方新諾明耐藥的菌株進(jìn)行Ⅰ類整合子及磺胺類耐藥基因sul1、sul2的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系、引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［7］（見表1）?；前奉惸退幓蜿?yáng)性對(duì)照株為本實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)陽(yáng)性且經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，GenBank登錄號(hào)分別為JN088221和JN088222，整合子陽(yáng)性對(duì)照株為本實(shí)驗(yàn)室保存［5］。所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由華大基因公司測(cè)序。

表1 擴(kuò)增引物序列及退火溫度Tab．1 Oligonucleotides for PCR analysis of integrons and suls and annealing temperature

2 結(jié) 果

2．1 香港海鷗菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 128株分離得到的海鷗菌對(duì)復(fù)方新諾明耐藥共20株，耐藥率15．6%，其中蛙源香港海鷗菌18株，魚源2株，耐藥率分別為20．22%和5．13%。

2．2 Ⅰ類整合子及磺胺類耐藥基因檢測(cè) 20株耐復(fù)方新諾明香港海鷗菌中，有16株Ⅰ類整合子檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率80%，整合子擴(kuò)增產(chǎn)物片段為可變區(qū)，大小在1 100～3 000 bp左右。

本次實(shí)驗(yàn)中共檢出sul1基因陽(yáng)性菌18株（90%），擴(kuò)增片段大小約為417 bp，sul2基因10株（50%），擴(kuò)增片段大小約為287 bp。16株Ⅰ類整合子陽(yáng)性株中，全部sul1基因陽(yáng)性（100%），10株sul2基因陽(yáng)性（62．5%），檢測(cè)到同時(shí)存在sul1和sul2兩種基因的有10株。有2株Ⅰ類整合子陰性株，然而sul1基因檢測(cè)陽(yáng)性。詳見表2。

實(shí)驗(yàn)中，另隨機(jī)抽取30株對(duì)復(fù)方新諾明敏感的菌株分別進(jìn)行3種基因的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)中分離的128株香港海鷗菌中磺胺類藥耐藥率15．6%，表明磺胺類耐藥存在一定的耐藥性。革蘭氏陰性腸道細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性與存在磺胺類耐藥基因（例如sul）有關(guān)，過(guò)去認(rèn)為革蘭氏陰性腸道細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性很大程度上是由質(zhì)粒介導(dǎo)，目前認(rèn)為Ⅰ類整合子也是介導(dǎo)耐藥性的重要元件［9－10］。整合子是存在于細(xì)菌基因組或質(zhì)粒上的基因片段，具有位點(diǎn)特異性重組功能，可存在于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)基因元件上，在不同種的細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，是細(xì)菌多重耐藥性形成和擴(kuò)散的重要原因。

表2 香港海鷗菌耐藥菌株及Ⅰ類整合子和磺胺類耐藥基因攜帶情況Tab．2 Class I integrons and sul genes detected in the 20 SXT－resistant Laribacter hongkongensis isolates

本研究結(jié)果顯示，在20株耐復(fù)方新諾明藥物的香港海鷗菌中，磺胺類耐藥基因sul1、sul2的檢出率分別為90%和50%，而30株復(fù)方新諾明敏感菌株的這兩種基因均為陰性，表明了香港海鷗菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥與sul基因，特別是sul1基因的存在密切相關(guān)。但本研究也發(fā)現(xiàn)有個(gè)別耐藥菌株sul基因陰性（2／20，表2），表明對(duì)磺胺類藥物的耐藥不僅有sul基因參與。本課題組前期的研究表明［5］，Ⅰ類整合子攜帶有5種類型基因盒：包括dfr A1－orf C，aad A1－dfr A，dfr A17－aad A5，dfr A14－arr2－cml A5，dfr A32－ere A－aad A2，其中dfr基因也是一種與磺胺類藥物耐藥有關(guān)的基因。

20株耐復(fù)方新諾明香港海鷗菌中，有16株Ⅰ類整合子檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率80%。在這16株Ⅰ類整合子陽(yáng)性的菌株中，sul1基因全部陽(yáng)性（16／16），sul2基因62．5%（10／16）陽(yáng)性。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明了Ⅰ類整合子可能是介導(dǎo)香港海鷗菌耐磺胺類藥物的主要元件。

Partridge等研究表明［10］，典型的整合子結(jié)構(gòu)包括它的5′－CS保守序列包含整合酶基因及它的3′－CS端保守序列包含qacE△1＋sul1基因分別編碼季胺類消毒劑和磺胺類耐藥基因，但是也存在3′端保守端缺失的現(xiàn)象。本研究中，在磺胺類耐藥整合子陽(yáng)性株中均檢出了sul1基因。而2株整合子基因檢測(cè)陰性，但是檢測(cè)存在sul1基因，是否是存在整合子3′端缺失的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步深入的研究。

研究中還觀察到，雖然部分菌株表現(xiàn)為對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，但是未檢測(cè)到Ⅰ類整合子、sul1和sul2基因，可能是其存在其他類型耐藥基因或存在其他的耐藥機(jī)制，例如生物膜的形成、外膜通透性改變和外排泵的過(guò)度表達(dá)都可能導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥［11］。因此，對(duì)于香港海鷗菌耐磺胺類藥物的機(jī)制的了解，還需要更多的研究。

隨著對(duì)香港海鷗菌研究的不斷深入，陸續(xù)自淡水魚、食用虎紋蛙、田螺、白鷺甚至水庫(kù)水體中發(fā)現(xiàn)香港海鷗菌的存在。Macros等學(xué)者［12］提出將香港海鷗菌與產(chǎn)腸毒素脆弱類桿菌、產(chǎn)酸克雷伯桿菌列入2004－2007年間新發(fā)現(xiàn)的3種引起人類急性細(xì)菌性腹瀉的病原體。香港海鷗菌作為一種新的細(xì)菌性腹瀉的病原體已受到廣泛關(guān)注。實(shí)驗(yàn)中首次對(duì)香港海鷗菌中磺胺類耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)香港海鷗菌攜帶磺胺類耐藥基因進(jìn)行初步的流行病學(xué)調(diào)查，豐富了耐藥基因的流行病學(xué)資料。

［1］Yuen K Y，Woo P C，Teng J L，et al．Laribacter hongkongensis gen．nov．，sp．nov．，a novel gram－negative bacterium isolated from a cirrhotic patient with bacteremia and empyema［J］．J Clin Microbiol，2001，39（12）：4227－4232．

［2］Woo P C，Lau S K，Teng J L，et al．Association of Laribacter hongkongensis in community－acquired gastroenteritis with travel and eating fish：a multicentre case－control study［J］．Lancet，2004，363（9425）：1941－1947．

［3］Ni X P，Ren S H，Sun J R，et al．Laribacter hongkongensis isolated from a patient with community－acquired gastroenteritis in Hangzhou City［J］．J Clin Microbiol，2007，45（1）：255－256．

［4］譚海芳，譚翰清，丁麗娜，等．篩選與確診試驗(yàn)在檢測(cè)香港海鷗菌中的建立與應(yīng)用［J］．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010（6）：675－677．

［5］Feng J L，Yan H，Chowdhury N，et al．Identification and characterization of integron－associated antibiotic resistant Laribacter hongkongensis isolated from aquatic products in China［J］．Int J Food Microbiol，2011，144（3）：337－341．

［6］Woo P C，Kuhnert P，Burnens A P，et al．Laribacter hongkongensis：a potential cause of infectious diarrhea［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2003，47（4）：551－556．

［7］Aarestrup F M，Lertworapreecha M，Evans M C，et al．Antimicrobial susceptibility and occurrence of resistance genes among Salmonella enterica serovar Weltevreden from different countries［J］．J Antimicrob Chemother，2003，52（4）：715－718．

［8］Levesque C，Piche L，Larose C，et al．PCR mapping of integrons reveals several novel combinations of resistance genes［J］．Antimicrob Agents Chemother，1995，39（1）：185－191．

［9］Vinue L，Saenz Y，Rojo－Bezares B，et al．Genetic environment of sul genes and characterisation of integrons in Escherichia coli isolates of blood origin in a Spanish hospital［J］．Int J Antimicrob Agents，2010，35（5）：492－496．

［10］Partridge S R，Tsafnat G，Coiera E，et al．Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons［J］．FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：757－784．

［11］Toleman M A，Bennett P M，Walsh T R．ISCR elements：novel gene－capturing systems of the 21st century［J］．Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（2）：296－316．

［12］Marcos L A，Dupont H L．Advances in defining etiology and new therapeutic approaches in acute diarrhea［J］．Journal of Infection，2007，55（5）：385－393．

Detection of the classⅠintegrons，sul1 and sul2 genes in trimethoprim－sulfamethoxazole resistant Laribacter hongkongensis isolates

CHEN Bing1，F(xiàn)ENG Jia－li1，LI Mei－xia2，ZHU Jiang－feng1，WEI Yao－h(huán)ong2，ZHANG Ou1，KANG Yan2，YU Shou－yi1，CHEN Qing1，HU Jing1

（School of Public Health and Tropical Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

The objective was to study the occurrence of sulphonamide resistance genes and classⅠintegrons in Laribacter hongkongensis（LH）isolates．The isolates were obtained from freshwater fishes and frogs．The trimethoprim－sulfamethoxazole（SXT）agent susceptibility was carried out by the K－B disk diffusion method，and all sulphonamide－resistant isolates were investigated for the presence of sul1，sul2 and class I integron genes by PCR．The 15．6% （20／128）of the Laribacter hongkongensis isolates were resistant to SXT．Among the SXT resistant isolates，sul1，sul2 and class I integron genes were detected out 90% （18／20），50% （10／20）and 80% （16／20），respectively．Results indicate that the mechanism of SXT－resistant LH isolates from freshwater fishes and frogs are likely to associate with sul1，sul2 and class I integron genes．

Laribacter hongkongensis；class I integron；sul gene

R378

A

1002－2694（2012）03－0223－03

＊國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No．30700686）和廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2009－2di－19）

胡靜，Email：hjalzh＠fimmu．com；陳清，Email：qch．2009＠163．com

1．南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣州510515；2．廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣州 510030

2011－09－26；

2011－12－20