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    Illumina測(cè)序技術(shù)在母血檢測(cè)胎兒非整倍體中應(yīng)用

    2012-01-24 13:57:40馮穗華黃泳華蔣馥蔓李衛(wèi)凱麥巧嬌瞿京輝張燕玲張紅云陳建勇
    關(guān)鍵詞:整倍體三體羊水

    馮穗華,王 威,黃泳華,陳 芳,蔣馥蔓,李衛(wèi)凱,麥巧嬌,瞿京輝,張燕玲,張紅云,陳建勇

    (1.江門(mén)市中心醫(yī)院 產(chǎn)科,廣東 江門(mén) 529000;2.深圳華大基因研究院)

    Illumina測(cè)序技術(shù)在母血檢測(cè)胎兒非整倍體中應(yīng)用

    馮穗華1,王 威2,黃泳華1,陳 芳2,蔣馥蔓2,李衛(wèi)凱1,麥巧嬌1,瞿京輝2,張燕玲1,張紅云2,陳建勇1

    (1.江門(mén)市中心醫(yī)院 產(chǎn)科,廣東 江門(mén) 529000;2.深圳華大基因研究院)

    目的 研究Illumina測(cè)序技術(shù)在母血中檢測(cè)胎兒非整倍體的可行性,及其在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用前景。方法68例孕12-39周具有產(chǎn)前診斷指征的單胎妊娠孕婦抽取外周血進(jìn)行離心、提取血漿中游離DNA,運(yùn)用Illumina Hiseq2000測(cè)序技術(shù)進(jìn)行DNA測(cè)序及統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果68例孕婦通過(guò)Illumina測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出3例21三體,2例18三體、1例13三體及1例47,XYY。因?yàn)闉l死胎兒羊水脫落細(xì)胞活力極低而致羊水培養(yǎng)失敗,傳統(tǒng)型染色體核型分析未檢測(cè)出1例21三體。結(jié)論Illumina測(cè)序作為一種無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù),可準(zhǔn)確地篩查21、18、13、X、Y等染色體非整倍體異常,具有安全、準(zhǔn)確率高及假陽(yáng)性率低的優(yōu)點(diǎn),值得臨床推廣。

    Illumina測(cè)序;無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷;非整倍體;胎兒

    (ChinJLabDiagn,2012,16:1213)

    我國(guó)每年將增加近100萬(wàn)出生缺陷兒童,占世界每年出生缺陷發(fā)生總數(shù)的20%左右,給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的精神負(fù)擔(dān),目前通過(guò)產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷系統(tǒng),并采取終止妊娠方式減少病患兒出生是有效的預(yù)防手段。傳統(tǒng)通過(guò)絨毛活檢、羊膜腔穿刺、臍帶穿刺采集胎兒標(biāo)本的有創(chuàng)性檢查具有一定的流產(chǎn)、早產(chǎn)及宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn),因此尋找并建立早期、快速、準(zhǔn)確且無(wú)創(chuàng)的產(chǎn)前診斷方法是目前臨床亟待解決的難題。本研究通過(guò)分離母體外周血中的胎兒游離DNA,利用新一代高通量Illumina測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序,分析胎兒染色體非整倍性變化達(dá)到無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的目的,現(xiàn)將相關(guān)研究報(bào)道如下:

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選擇2010年2月至2011年1月在我院產(chǎn)科就診,妊娠12-39周的單胎妊娠孕婦68例,年齡22-43歲,本組孕婦均有羊水檢查或臍血檢查胎兒染色體指征(高齡、唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲異常、不良孕產(chǎn)史或患者夫婦之一染色體異常等)。

    1.2 方法

    1.2.1 主要試劑和儀器 DNA 提取:QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen,Hilden,Germany);文庫(kù)制備試劑:Genomic DNA Library Preparation Kit((Illumina),Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide kit(Illumina);測(cè)序:Hiseq2000;Sequencing Kit V3 (Illumina);數(shù)據(jù) 分 析:Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases(ELAND);染色體核型分析:Aloka SSD-3500SX 超聲診斷儀及VideoTesT-Karyo全自動(dòng)染色體核型分析系統(tǒng)

    1.2.2 步驟

    ①簽署知情同意書(shū)后,EDTA管采集8-10ml孕婦外周血。4℃1 600g離心10min,分離血漿,再4℃16 000g離心10min去除殘余細(xì)胞,抽取血漿3-5ml,置于離心管內(nèi)-80℃保存。

    ②提取血漿中游離DNA,在血漿游離DNA片段的兩個(gè)末端加上接頭,構(gòu)建DNA文庫(kù)。

    ③Illumina新一代測(cè)序技術(shù)測(cè)序,利用專利的芯片,制備DNA簇,邊合成邊測(cè)序,自動(dòng)讀取堿基,數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析,根據(jù)公式[1]:某染色體含量(%Chr N)=某染色體唯一序列讀取數(shù)/參考序列染色體N上基因組唯一序列總數(shù);測(cè)試樣本Chr N的關(guān)聯(lián)Z-Score=(%chr N檢測(cè)樣品 –%chr N對(duì)照組平均值)/S.D.%chr N對(duì)照組,計(jì)算每條染色體的Z-score值,Z-score值≥3為非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本,-3<Z-score值<3為非整倍體低風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本,給出分析報(bào)告。

    ④本組孕婦孕16周后抽取羊水或臍血行胎兒染色體分析,判斷本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果

    2.1 羊水及臍血染色體結(jié)果

    68例孕婦中1例孕19周21三體篩查高風(fēng)險(xiǎn)(風(fēng)險(xiǎn)值1:2),羊水深褐色,胎心80次/分,羊水穿刺術(shù)后胎兒2小時(shí)死亡病例,羊水培養(yǎng)失敗。其余67例均培養(yǎng)成功,檢查結(jié)果21三體2例,18三體2例,13三體1例,13單體嵌合部分13環(huán)狀染色體1例,9號(hào)倒位1 例,47,XYY1例,46,XX,14PS+1例,正常染色體核型58例。

    2.2 Illumina測(cè)序結(jié)果

    68例孕婦外周血均成功提取DNA,根據(jù)測(cè)序及統(tǒng)計(jì)每條染色體的Z-score值所得出的結(jié)果分析,檢測(cè)出3例21三體(其中1例唐氏篩查1:2,羊水培養(yǎng)失敗的胎兒,經(jīng)檢測(cè)為21三體),2例18三體,1例47,XYY,1例13三體,其余樣本檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)異常。

    3 討論

    由于傳統(tǒng)的唐氏篩查包括早孕期血清學(xué)聯(lián)合NT篩查及中孕期血清學(xué)篩查,其檢出率低,假陽(yáng)性率高達(dá)5%,受孕周影響,僅可以在孕11-21周進(jìn)行篩查,而有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有一定的流產(chǎn)率,隨著醫(yī)學(xué)倫理學(xué)及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的不斷完善,無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注。

    3.1 母體胎兒游離DNA來(lái)源

    母體胎兒游離DNA來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、孕婦血液中游離胎兒細(xì)胞及胎兒組織發(fā)育過(guò)程中自然凋亡的 DNA[2,3,4,5]。1997年 Dennis Lo[6]在母體血漿中檢出胎兒游離DNA,在孕5周開(kāi)始隨著孕周的增加母體中游離DNA濃度相應(yīng)增加[7],分娩后2小時(shí)迅速降解消失,其半衰期為4~30min[8]。Bischoff[9]等報(bào)道胎兒DNA占孕婦血漿中總DNA的5-7%,這一重大發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

    3.2 Illumina高通量測(cè)序技術(shù)篩查胎兒非整倍體原理

    孕婦血漿中胎兒DNA含量低,需要選擇超級(jí)靈敏的分子生物技術(shù)才可以對(duì)胎兒游離DNA進(jìn)行判斷。Illumina測(cè)序技術(shù)為新一代測(cè)序技術(shù),具有高通量DNA測(cè)序能力,可以測(cè)定樣本中的基因組信息和數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的DNA分子數(shù)量,判斷母血中微量胎兒異常DNA擾動(dòng)。Illimula測(cè)序技術(shù)對(duì)母體血中所有游離DNA(包括胎兒游離DNA)進(jìn)行基因測(cè)序,根據(jù)人類(lèi)基因組的不同染色體上的特定位點(diǎn)和唯一基因序列片段特征,通過(guò)比對(duì)獲得所測(cè)得的每條序列的位置信息,定位到相應(yīng)的染色體上,并根據(jù)統(tǒng)計(jì)獲得分布在每條染色體上的序列條數(shù),由此計(jì)算n染色體所占比率。含有非整倍體胎兒DNA的母血樣本,其異常染色體上的序列條數(shù)比正常二倍體的樣品的多,應(yīng)用生物信息工具,放大并分析外周血中不同染色體含量的差異,從而精確識(shí)別胎兒染色體非整倍體異常。

    3.3 Illumina測(cè)序技術(shù)檢測(cè)非整倍體的準(zhǔn)確性及優(yōu)點(diǎn)

    2008年Fan HC等[10]利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)孕婦血漿內(nèi)胎兒游離DNA進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析正確區(qū)分了9例21三體、2例18三體和1例13三體;Chiu RW等[10]在2008年也利用了新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)血漿內(nèi)游離DNA進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)Z-score模型分析數(shù)據(jù),正確區(qū)分了14例21三體。而在我們的研究中,經(jīng)過(guò)與羊水、臍血染色體比對(duì),正確區(qū)分了2例21三體,1例18三體,1例47,XYY。值得一提的是,本研究有1例羊水培養(yǎng)失敗,原因是由于胎兒瀕死且羊水呈墨綠色,羊水中脫落細(xì)胞的活力降低,羊水細(xì)胞不能貼壁生長(zhǎng),但I(xiàn)llumina測(cè)序技術(shù)將其DNA片段提取、測(cè)序并分析,證實(shí)為21三體兒,彌補(bǔ)了羊水培養(yǎng)的缺點(diǎn),凸顯其診斷的優(yōu)越性。Illumina測(cè)序技術(shù)檢測(cè)非整倍體具有以下優(yōu)點(diǎn)[1,10,11]:(1)無(wú)創(chuàng)傷,無(wú)流產(chǎn)及感染風(fēng)險(xiǎn);(2)該檢測(cè)技術(shù)可以用于檢測(cè)21、18、13、X、Y等染色體非整倍體,準(zhǔn)確率高達(dá)99%以上;(3)受孕周影響小,可檢測(cè)孕12周以上的妊娠;(4)檢測(cè)周期短;(5)可作為一種產(chǎn)前篩查技術(shù),極低的假陽(yáng)性率可大幅降低創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷比例,緩解臨床壓力。

    3.4 Illumina測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)

    本研究中染色體核型為13單體嵌合部分13環(huán)狀染色體、9號(hào)倒位、14PS+的病例在新一代測(cè)序技術(shù)中,結(jié)果顯示均為正常。因?yàn)闄z測(cè)的是游離DNA中的堿基序列片段,對(duì)于無(wú)堿基序列增多或減少的平衡易位及嵌合體、環(huán)狀染色體等染色體異常,Illumina測(cè)序不能精確檢測(cè)出來(lái),同理不能精確檢測(cè)非單絨毛膜性質(zhì)的多胎妊娠。對(duì)于孕婦前期接受過(guò)異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療者,因?yàn)橐胪庠葱訢NA,也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

    綜上所述,Illumina測(cè)序可準(zhǔn)確地篩查21、18、13、X、Y等染色體非整倍體異常,具有安全、準(zhǔn)確率高及假陽(yáng)性率低的優(yōu)點(diǎn),取代傳統(tǒng)的唐氏篩查方法是可行的。但由于本研究的樣本量小,需要加大樣本進(jìn)一步研究,達(dá)到應(yīng)用臨床的目的。

    致謝:深圳華大基因研究院完成所有的樣品的DNA文庫(kù)、DNA測(cè)序、生物信息分析基因測(cè)序及統(tǒng)計(jì)分析工作,作為其合作單位之一,我們對(duì)此致以深切感謝!

    [1]Chiu RW,Chan KC,Gao Y,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(51):20458.

    [2]Bianchi DW.Circulating fetal DNA:its origin and diagnostic potential-a review[J].Placenta,2004,25Suppl A:S93.

    [3]Sekizawa A,Samura O,Zhen DK,et al.Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood[J].Prenat Diagn,2000,20(11):886.

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    [5]費(fèi)明鈺,張 毅,賈 音,等.母血中胎兒遺傳物質(zhì)與無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷[J].分子診斷與治療雜志,2011,2(6):428.

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    [11]Chiu RW,Sun H,Akolekar R,et al.Maternal plasma DNA analysis with massively parallel sequencing by ligation for noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21[J].Clin Chem,2010,56(3):459.

    Detecting fetal chromosomal aneuploidy by Illumina-solexa sequencing DNA in maternal plasma

    FENGSui-hua,WANG Wei,HUANGYong-hua,etal.(DepartmentofObstetrics,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529000,China)

    ObjectiveTo study the feasibility of detecting fetal chromosomal aneuploidy and the perspective of noninvasive prenatal diagnosis by Illumina sequencing DNA in maternal plasma.Methods68singleton pregnant women with gestation weeks of 12-39were recruited.Maternal plasma DNA was extracted and sequenced on Illumina/Hiseq2000platform for subsequent statistics analysis.ResultsThree cases of trisomy 21,two cases of trisomy 18,one cases of trisomy 13,one cases of 47,XYY were successfully indentified by Illumina sequencing.One case of trisomy 21 wasn’t detected in traditional karyotyping analysis because the cell of amniotic fluid had exceeding low vitality in the dying fetus.ConclusionAs a kind technique of noninvasive prenatal diagnosis,Illumina sequencing Of maternal plasma DNA was effective in identifying fetal chromosomal aneuploidy such as 21,18,13,X,Y.Considering its accuracy and security,it Would be worth spreading in clinic.

    Illumina sequencing;noninvasive prenatal diagnosis;aneuploidy;fetus

    R714.3

    A

    1007-4287(2012)07-1213-03

    2011-08-07)

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