殼聚糖對大腸埃希菌生物被膜耐藥性的影響

胡金樹，于慶杰，朱一堂，丁繼生

（滄州市中心醫(yī)院 檢 驗科，河北 滄 州061001）

細菌生物被膜是發(fā)生呼吸機相關(guān)性肺炎的重要原因，在對生物被膜的研究中很多物質(zhì)能抑制生物被膜，但增加了細菌的耐藥性，本文主要研究殼聚糖對大腸埃希菌生物被膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗菌株：臨床標本中分離，經(jīng)API20E鑒定的大腸埃希菌；藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.1.2 材料和儀器 殼聚糖：分子量30萬，脫乙酰度大于85%，浙江金殼生物化學有限公司；氣管導管規(guī)格8.0 mm，廣州韋士泰醫(yī)療器械有限公司。

藥敏紙片：OXIOD公司，分別是哌拉西林／他唑巴坦（TZP）、左氧沙星（LEV）、亞胺培南（IPM）、慶大霉素（CN）、阿米卡星（AK）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢呋新（CXM）、阿莫西林／棒（AMC）、頭孢西?。‵OX）、頭孢噻肟／克拉維酸 （CTX／CLAX）、頭孢他啶／克 拉 維 酸（CAZ／CLAV）。

儀器：掃描電子顯微鏡：日本電子JSM－5600LV型。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生物被膜模型的培養(yǎng) 稱量殼聚糖適量放入3%乙酸溶液10 ml中浸泡后，加入適量甘油和無水乙醇攪拌均勻，在導管內(nèi)壁涂層，自然干燥后放入10%NaOH溶液中固定20 min，用蒸餾水沖洗至中性。取新鮮菌落放入生理鹽水，調(diào)至吸光度為0.145，以此作為菌懸液。按文獻方法［1］并改良。吸取0.1 ml菌懸液種入含有4.9 ml生理鹽水及1 cm長導管的無菌杯中（導管水平放置），36℃培養(yǎng)，隔日更換液體，培養(yǎng)7 d得到BF。7天后，將導管的外壁用酒精紗布反復擦拭，生理鹽水反復沖洗其內(nèi)壁、外壁和套囊孔，以去除未粘附細菌及殘余酒精。

1.2.2 實驗分組 空白組為浮游菌組，對照組為由空白導管制備的生物被膜組，實驗組為包被分子量30萬殼聚糖的導管制備的生物被膜組，每組標本為12例。

1.2.3 掃描電鏡觀察對照組和實驗組

1.2.4 酶的檢測和細菌藥敏 ESBLs的檢測，CTX、CTX／CLAX 及 CAZ、CAZ／CLAV 中任何1對紙片抑菌環(huán)直徑差≥5 mm時，判斷為ESBLs陽性株。肺炎克雷伯ATCC700603作為陽性對照。Amp C的檢測，先用FOX檢測，抑菌環(huán)直徑≤18 mm的菌株，若FEP、TPM 表現(xiàn)為敏感，而CTX、CTX／CLAX 和 CAZ／CLAV 表現(xiàn)為耐藥，或在CTX、CTX／CLAX和CAZ／CLAV的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在的菌落，判斷為Amp C陽性。陰溝腸桿菌029M作為AmpC酶陽性對照，肺炎克雷伯ATCC700603作為Amp C酶陰性對照。藥敏采用KB法，判斷標準以CLSI為準則。

1.2.5 統(tǒng)計方法 兩組之間各酶的檢出率進行χ2檢驗，設P＜0.05有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 對照組和實驗組的電鏡照片 圖中對照組細菌數(shù)量明顯比實驗組多，不但證明該方法能夠形成生物被膜，還證明30萬分子量的殼聚糖能抑制大腸埃希菌的生物被膜。

表1 各組酶的檢出結(jié)果（菌株／檢出率%，n＝12）

圖1 各實驗組的電鏡照片

2.2 藥敏結(jié)果 各組對亞胺培南的耐藥率最低，其次是對加酶抑制劑的抗生素耐藥率較低，對照組、實驗組對抗生素的耐藥性高于空白組。整個結(jié)果見表2。

表2 各組的藥敏率（菌株／耐藥率%）

隨著對生物被膜的研究，發(fā)現(xiàn)了許多物質(zhì)對其有抑制作用，但有的增加了耐藥性［2］、對人體毒性［3］等副作用。殼聚糖是不但對人體細胞無毒［4］，而且能夠抑制生物被膜的形成［5］。

本實驗首次選用大腸埃希菌來研究殼聚糖對生物被膜細菌耐藥性的影響。耐藥性的比較以ESBLs和AmpC來研究。ESBLs由質(zhì)粒介導，可通過接合、轉(zhuǎn)化和傳導等方式在細菌種屬之間進行傳遞。Amp C酶是指由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的“絲氨酸”頭孢菌素酶組成的一個酶家簇。

結(jié)果表明生物被膜兩組ESBLs和Amp C酶的檢出率均明顯高于浮游組各酶的檢出率。其中原因可能為BF的細菌無論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性及致病特點等都與浮游生長的細菌顯著不同，開啟了耐藥基因，具有很強的耐藥性［6］。由于BF的形成，促進了AmpC和ESBLs的產(chǎn)生，而這兩種酶同時存在又增加了耐藥性，但是亞胺培南的抗菌活性最高，無耐藥菌株。從藥敏結(jié)果來看，對其他抗生素的耐藥性較高，可知，對于該菌感染一定要在藥敏實驗的指導下進行治療。對照組和實驗組的耐藥性沒有差異，殼聚糖沒有影響生物被膜細菌的耐藥性，可能是殼聚糖殺滅細菌的機理是進入細菌干擾其帶負電荷的遺傳物質(zhì)DNA和RNA，抑制細菌的繁殖，是一種物理的靜電吸引作用，不同于常規(guī)的化學藥物［7］。

綜上所述殼聚糖既對人體無毒無害、可抑制生物被摸的形成，又未增加細菌的耐藥性，在醫(yī)學有潛在價值。

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