金蓮花真?zhèn)舞b別與質(zhì)量評價方法研究進展△

孫萍，李新朋，薛濤，辛杰，劉言娟，陳虞超，郭生虎*，張波*

1.臨沂大學(xué) 藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；

2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002

金蓮花為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花Trollius chinensisBge.的干燥花，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，臨床主要用于各種炎癥，如咽炎、扁桃體炎、腮腺炎和呼吸道感染等[1-3]。金蓮花作為藥用始見于《本草綱目拾遺》，后被《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）1977 年版[4]收錄（未被后續(xù)《中國藥典》收錄），1998 年被收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》[5]。金蓮花不僅以傳統(tǒng)飲片入藥，還應(yīng)用于較多制劑，如金蓮花片、金蓮花膠囊、金蓮花顆粒、金蓮花口服液等。

據(jù)統(tǒng)計，金蓮花屬植物共25 種，其中我國有16種，分布在東北、西北、華北、西南和臺灣等地。除金蓮花外，同屬植物短瓣金蓮花T.ledebouriReichb.e、阿爾泰金蓮花T.altaicusL.、川陜金蓮花T.buddaeSchipcz.等亦有較多資源開發(fā)利用的研究[6]，在藥用上容易造成混淆。為明確金蓮花作為中藥使用的唯一植物基原，確保金蓮花的質(zhì)量及療效，本文從性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、紅外光譜（FTIR）鑒別、分子鑒別、含量測定、指紋圖譜評價等多個角度綜述了近20 年金蓮花的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價方法研究進展，為金蓮花的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 真?zhèn)舞b別方法

1.1 性狀鑒別

金蓮花呈不規(guī)則團塊狀，皺縮，整體呈金黃色，直徑1.0～2.5 cm，展平后直徑2.0～5.2 cm，常帶有灰綠色花柄；花萼卵形或倒卵形，金黃色，10～16片，長1.8～3.0 cm，寬0.9～2.0 cm；花瓣線形，金黃色，多數(shù)，長1.4～2.5 cm，寬0.1～0.3 cm；雄蕊黃白色，心皮離生，多數(shù)，長0.7～1.5 cm；雌蕊具短喙，棕黑色，多數(shù)；子房20 多個聚合；花柱芒尖狀；體輕，疏松；氣芳香，味微苦[7-8]。此外，通過水試法，金蓮花可將水染成金黃色[9]。

1.2 顯微鑒別

金蓮花粉末特征較為明顯：呈黃色；花粉粒類圓形，表面略突起，但無明顯分層，有時可見3個萌發(fā)孔，淡黃色或無色，數(shù)量眾多，直徑15～20 μm；花瓣表皮細(xì)胞呈乳突狀隆起，淡黃色，直徑28～40 μm，部分細(xì)胞腔中含黃棕色顆粒狀物；花粉囊內(nèi)壁組織呈大小不一的塊片狀，淡黃色，直徑8～24 μm，細(xì)胞壁側(cè)面呈鏈珠狀增厚；導(dǎo)管成束，少單個，螺紋導(dǎo)管，直徑5～12 μm；氣孔不定式，類圓形或橢圓形，直徑36～40 μm，副衛(wèi)細(xì)胞4～5 個，垂周壁彎曲；單細(xì)胞非腺毛，棒狀，少數(shù)含黃色內(nèi)含物，長400～500 μm[7-9]。蘭冬冬等[10]發(fā)現(xiàn)，金蓮花中也含有梯紋導(dǎo)管，直徑20～30 μm，且氣孔亦有不等式氣孔，直徑約45 μm。

1.3 理化鑒別

《中國藥典》1977 年版通過熒光反應(yīng)鑒別金蓮花真?zhèn)?，即將金蓮花乙醇提取液點于濾紙上，并噴灑2%三氧化鋁乙醇溶液，紫外燈下顯黃綠色熒光[4]。此外，金蓮花還可通過微量升華實驗和薄層色譜進行真?zhèn)舞b別。

1.3.1 微量升華實驗 白云娥等[8]按照微量升華法對金蓮花粉末進行檢測，發(fā)現(xiàn)載玻片上可見淡黃色的雪花樣結(jié)晶，此現(xiàn)象可作為金蓮花的理化鑒別方法之一。

1.3.2 薄層色譜鑒別 薄層色譜具有簡便高效的特點，在中藥鑒別中應(yīng)用十分廣泛，但《中國藥典》1977 年版并未收載金蓮花的薄層色譜鑒別方法。楊天壽等[11-12]分別采用聚酰胺薄膜和硅膠G為固相載體，以葒草苷和牡荊素為對照品建立了金蓮花的鑒別方法，其中聚酰胺薄膜使用的展開系統(tǒng)為三氯甲烷-甲醇-丁酮-冰醋酸（4∶2∶3∶3），硅膠G薄層板配套的展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶8∶1∶1），兩套系統(tǒng)均需要使用1%三氯化鋁乙醇溶液顯色，且加熱后紫外顯色效果較好。齊武強等[13]以葒草苷為對照品，以聚酰胺薄膜為載體，三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7∶3∶4）為展開劑建立了金蓮花鑒別方法，其優(yōu)點在于樣品提取方法為超聲提取后濾過即可，不需要使用乙酸乙酯或正丁醇萃取濃縮等操作，方法進一步簡化。除以對照品作為指標(biāo)對照檢測之外，汪海宣等[14]以金蓮花標(biāo)準(zhǔn)藥材為對照藥材，以硅膠G 薄層板為載體，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶1∶1∶0.1）為展開系統(tǒng)，以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色建立了金蓮花的薄層鑒別方法，該方法的優(yōu)點在于斑點個數(shù)多，能夠更全面地反映藥材的化學(xué)成分特征。

1.4 FTIR鑒別

FTIR 具有取樣量小、操作簡單、測試快速、指紋特性強、無污染等諸多優(yōu)點。潘艷麗等[15]通過傅里葉FTIR 對金蓮花水提取物進行光譜檢測發(fā)現(xiàn)，金蓮花有12 個特征峰，波數(shù)為3400～540 cm-1，并明確了其主要成分葒草苷和牡荊苷的表征峰分別為2855、1252 cm-1；進一步通過二階導(dǎo)數(shù)光譜分析發(fā)現(xiàn)，在1500～1480 cm-1不同產(chǎn)地及不同貯存時間的金蓮花提取物特征峰有明顯差異，說明通過一維FTIR 可鑒別金蓮花的產(chǎn)地，通過二階導(dǎo)數(shù)光譜可實現(xiàn)金蓮花貯存期限鑒別。聶波等[16]研究發(fā)現(xiàn)，不同金蓮花藥材FTIR 圖譜均具有1700～1500、1500～1340、1340～1200、1200～1000、1000～400 cm-1五大峰群，且通過這些峰的峰形、峰位及峰強度的差異可以實現(xiàn)金蓮花不同產(chǎn)地、不同生境、不同品種、不同生長年限、不同干燥方法的快速鑒別。

不同提取溶劑提取的中藥組分，組成及成分比例有所差異，其FTIR 檢測結(jié)果也有所差異。汪海宣等[14]分別采用石油醚和甲醇作為溶劑對金蓮花進行提取并考察了其FTIR，共發(fā)現(xiàn)了8 個特征波數(shù)段，為金蓮花的真?zhèn)舞b別提供了參考。

1.5 中藥材DNA條形碼分子鑒定法

中藥材DNA 條形碼分子鑒定法是基于中藥遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來研究物種內(nèi)在的遺傳變異而實現(xiàn)藥材鑒別的方法，主要具有取樣量小、不依賴藥材形態(tài)與部位、結(jié)果客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點，是近年來中藥鑒別研究領(lǐng)域的熱點[17]。

隨機擴增多態(tài)性DNA 標(biāo)記技術(shù)（RAPD）是較早的中藥分子鑒別技術(shù)，其以DNA 為模板，以單個人工合成的隨機核苷酸序列為引物，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增后觀察電泳條帶，結(jié)果直觀可見。李勇等[18]通過30 條引物共擴增194 條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶108 條，多態(tài)性位點百分率為55.67%；進一步通過非加權(quán)配對平均法（UPGMA）進行聚類分析，可將24 份金蓮花樣品分為三大類，說明通過RAPD可實現(xiàn)金蓮花的產(chǎn)地鑒別。

隨著分子鑒別技術(shù)的發(fā)展及植物基因信息的挖掘，分子鑒別方法得到廣泛認(rèn)可，加快了中藥鑒別標(biāo)準(zhǔn)化的進程。其中DNA 條形碼技術(shù)可根據(jù)一段通用DNA 片段實現(xiàn)對物種的快速鑒別，具有通用性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、利于接軌國際平臺等優(yōu)點，發(fā)展十分迅速[19]。崔欣萍等[20]利用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）這一通用序列建立了金蓮花的DNA條形碼鑒別方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金蓮花屬植物特異性PCR 擴增產(chǎn)物大小約為480 bp，通過構(gòu)建鄰接法（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹可準(zhǔn)確鑒別金蓮花和淡紫金蓮花。

1.6 其他鑒別方法

利用高效液相色譜法（HPLC）的高效分離能力結(jié)合質(zhì)譜法（MS）的結(jié)構(gòu)鑒別能力，可有效表征中藥的化學(xué)成分特征。黃睿等[21]通過HPLC-MS 對金蓮花中的化學(xué)組方進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葒草苷、牡荊苷和葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷3 個成分的分子峰信息為金蓮花的特征峰，可作為金蓮花真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價的指標(biāo)成分。

不同物種所含蛋白質(zhì)種類不同，同一物種在不同產(chǎn)地、不同生長階段或不同生長年限其蛋白質(zhì)水平上也存在差異，基于此原理可以蛋白質(zhì)為信息物質(zhì)對中藥進行鑒別。張麗娟[22]通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對金蓮花中的蛋白質(zhì)進行分析研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9 個金蓮花樣品中均含有10～14 條蛋白質(zhì)譜帶，但不同樣品在譜帶數(shù)量、級別和分布上有明顯差異，提示可根據(jù)蛋白質(zhì)譜帶信息進行金蓮花的鑒別。

不同中藥的元素含量、化學(xué)物質(zhì)聚集狀態(tài)及中藥本身存在的一些晶態(tài)物質(zhì)，其晶粒尺寸均不同，通過X 射線衍射之后會呈現(xiàn)出不同的衍射圖譜。通過金蓮花的X 射線衍射研究和X 射線熒光分析發(fā)現(xiàn)，金蓮花中含有納米級的天然結(jié)合型富鉀晶態(tài)物質(zhì)，此現(xiàn)象在中藥中較為少見，可作為金蓮花的鑒別參考。此外，通過X 射線衍射基本數(shù)據(jù)庫的建立可實現(xiàn)金蓮花及金蓮花粉末在中成藥中的快速鑒別[23]。

2 質(zhì)量評價方法

目前尚沒有法定的金蓮花質(zhì)量優(yōu)劣評價方法，但根據(jù)現(xiàn)有研究可將金蓮花質(zhì)量評價方法分為兩類，即基于單個、多個或一類化學(xué)成分分析的含量測定方法、主成分分析法和基于指紋圖譜技術(shù)的質(zhì)量評價方法。

2.1 基于化學(xué)成分含量測定的質(zhì)量評價方法

2.1.1 指標(biāo)成分含量測定評價 研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花中含有黃酮類、有機酸類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分，其中黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高達(dá)15%，又以葒草苷和牡荊苷含量最高[24]；此外，葒草苷和牡荊苷具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種藥理活性[25-27]，亦是可被腸道有效吸收的主要黃酮類成分[28]。因此，現(xiàn)有金蓮花的質(zhì)量評價方法中多以此2 種黃酮類成分作為質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分。但也有結(jié)合酚酸類成分（如藜蘆酸）或生物堿類成分（如金蓮花堿）及其他成分作為質(zhì)量評價指標(biāo)的研究，目的在于提高金蓮花質(zhì)量評價的全面性。

對于金蓮花指標(biāo)成分含量評價的方法多以HPLC為主，其具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、自動化程度高、利于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在《中國藥典》2020 年版中廣泛應(yīng)用。金蓮花的HPLC 質(zhì)量評價方法信息見表1。由表1可知，多數(shù)研究的檢測成分?jǐn)?shù)量為1～5個，但Song等[36]建立的金蓮花HPLC 定性定量檢測方法可同時檢測19 個黃酮類成分，極大地提高了金蓮花質(zhì)量評價的全面性。

表1 金蓮花HPLC質(zhì)量評價方法

2.1.2 揮發(fā)性成分含量測定評價 揮發(fā)性成分不但具有芳香氣味，還具有多種藥理功效，是評價花類藥材的重要指標(biāo)之一。姬小明等[37]研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花中含有月桂酸、十四酸、十六酸乙酯、二十三烷、二氫獼猴桃內(nèi)酯等38 個揮發(fā)性成分。秦文斌等[38]針對此38個揮發(fā)性成分利用分子價連接性指數(shù)和原子類型電性拓?fù)錉顟B(tài)指數(shù)進行結(jié)構(gòu)表征，并結(jié)合揮發(fā)性成分的色譜保留時間進行回歸分析，建立了定量結(jié)構(gòu)-色譜保留關(guān)系模型，該模型對金蓮花的質(zhì)量評價具有一定指導(dǎo)意義。此外，侯冬巖等[39]利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析了遼寧和內(nèi)蒙古產(chǎn)金蓮花中的脂肪酸種類及含量差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遼寧產(chǎn)金蓮花含11種脂肪酸（占總檢出量的75.08%），而內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)金蓮花含13種脂肪酸（占總檢出量的72.41%），2個差異脂肪酸為十五烷酸和十六烷酸，提示金蓮花揮發(fā)性成分受產(chǎn)地生境影響較顯著。

2.1.3 微量元素含量測定評價 金蓮花不僅可作為藥用，還可用于茶飲，素有“塞上龍井”之稱，其中微量元素是水溶性成分之一。微量元素不僅與人體正常新陳代謝息息相關(guān)，在預(yù)防和治療疾病方面也具有重要作用。微量元素的種類及含量是生物體遺傳因素、生境元素豐度及物種生長階段需要選擇性吸收等多種因素的結(jié)果，因此，從微量元素的角度進行中藥質(zhì)量評價切實可行[40]。

張莉等[41]研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花中含有Fe、Mg、Cu、Zn、Mn、Cr、Pb、As 8 種元素，且金蓮花中多種人體必需微量元素含量遠(yuǎn)高于糧食、蔬菜、肉類等。梁永峰[40]比較了人工種植金蓮花與野生金蓮花樣品中K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu 等元素的含量，發(fā)現(xiàn)兩者基本一致，說明從無機元素的層面評價，人工種植品可滿足藥用及茶用要求。李桂蘭等[42]研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地金蓮花中Ca和Fe的含量相差不大，而Mn、Cu、Zn的含量則差異較為顯著。

2.1.4 其他成分含量測定及評價 除黃酮類、有機酸類、生物堿類、揮發(fā)油類及微量元素外，金蓮花中還含有一定的多糖和油脂類成分。王瑋等[43]以葒草苷、金絲桃苷、槲皮素、藜蘆酸、總黃酮、多糖和油脂7 個單體或類別成分為品質(zhì)指標(biāo)，通過主成分分析共提取了3 個主成分，累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)79%，并構(gòu)建了綜合評價模型，最終利用此模型評價了河北、遼寧、山西、黑龍江、內(nèi)蒙古、新疆等地的金蓮花品質(zhì)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古烏蘭浩特、河北省沽源縣和黑龍江加格達(dá)奇的金蓮花品質(zhì)較好。主成分分析法是一種多元統(tǒng)計分析方法，是在含量測定的基礎(chǔ)上通過將多指標(biāo)的特點綜合成差異顯著且能夠反映原指標(biāo)信息的少數(shù)指標(biāo)，進而對中藥質(zhì)量進行評價[44]，可在一定程度上提升質(zhì)量評價的全面性。

2.2 指紋圖譜評價

中藥指紋圖譜可反映中藥化學(xué)成分的整體情況，避免以單個或一類成分評價藥材質(zhì)量的局限性，符合中藥自身特點，被業(yè)界廣泛認(rèn)可。目前，針對金蓮花的指紋圖譜主要基于HPLC技術(shù)。金蓮花HPLC指紋圖譜信息見表2。與HPLC 相比，超高效液相色譜法（UPLC）的優(yōu)勢在于檢測更為快速（檢測時間可縮短30%以上），效率更高。雷蓉等[49]利用UPLC 技術(shù)進行了金蓮花屬植物的指紋圖譜研究，其以38 批金蓮花屬植物為研究對象（包括金蓮花、短瓣金蓮花和阿爾泰金蓮花），共標(biāo)定了26 個特征峰，然后以峰面積最大的色譜峰為參照峰，結(jié)合聚類分析的化學(xué)計量學(xué)方法，可將金蓮花、短瓣金蓮花和阿爾泰金蓮花進行快速鑒別。

表2 金蓮花HPLC指紋圖譜研究

此外，Yuan等[50]將HPLC 與MS 聯(lián)用，將HPLC的高效分離能力與MS 的化學(xué)成分鑒別相結(jié)合，建立的金蓮花的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了32個共有峰，且實現(xiàn)了其中13 個成分的定性和定量分析，可較全面地評價金蓮花的質(zhì)量。

3 討論

金蓮花具有多種藥理活性且臨床應(yīng)用廣泛，但由于《中國藥典》1985 年版至2020 年版未收載本品，且其他標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于金蓮花的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價方法規(guī)定亦不全面，限制了金蓮花的進一步開發(fā)利用。

作為藥用，《中國藥典》1977 年版僅收錄了金蓮花1 種植物基原，但在部分地區(qū)其他同屬植物也一并入藥使用，容易導(dǎo)致有效性及安全性方面的問題，因此真?zhèn)舞b別是保障藥材質(zhì)量的前提。目前，金蓮花現(xiàn)有真?zhèn)舞b別方法主要有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、FTIR 鑒別、中藥材DNA 條形碼分子鑒定法等。性狀鑒別、顯微鑒別及理化鑒別等方法可有效實現(xiàn)金蓮花與其他科屬植物的真?zhèn)舞b別，但難以實現(xiàn)與其同屬其他植物的鑒別，如地方用藥品種短瓣金蓮花、阿爾泰金蓮花、川陜金蓮花等。FTIR 鑒別法和中藥材DNA 條形碼分子鑒定法可實現(xiàn)品種間的真?zhèn)舞b別，但同樣存在較多問題。例如，對于鑒別結(jié)果最為準(zhǔn)確的分子鑒別方法的研究還停留在較早的RAPD 技術(shù)，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）、微衛(wèi)星DNA（SSR）、簡單重復(fù)序列間擴增（ISSR）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）等新型DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在金蓮花真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用有待開發(fā)；而基于ITS 序列的DNA 條形碼技術(shù)研究中金蓮花品種僅2 個，方法實用性存疑，有必要對金蓮花屬植物進行廣泛收集，并進行方法適用性的進一步驗證。

金蓮花野生資源較少，現(xiàn)多以人工種植為主，但其產(chǎn)區(qū)分布較廣，寧夏、河北、新疆、黑龍江、遼寧、陜西、山西等地均有栽培，因此其質(zhì)量存在一定差異。目前，金蓮花的質(zhì)量評價方法主要有：1）以葒草苷、牡荊苷等幾個黃酮類成分為指標(biāo)的定量檢測方法；2）以揮發(fā)油、微量元素等成分為指標(biāo)的質(zhì)量評價方法；3）HPLC 指紋圖譜評價方法。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，金蓮花中的黃酮類成分是其發(fā)揮抗菌、抗病毒及抗炎的主要活性成分[51]，而這正是與金蓮花藥材清熱解毒功效相匹配的成分。因此，建議將黃酮類成分，如葒草苷、牡荊苷等作為金蓮花質(zhì)量控制指標(biāo)性成分，同時以揮發(fā)油含量測定、水浸出物含量測定等作為綜合性評價指標(biāo)。

金蓮花藥理活性顯著，且在金蓮花片、金蓮花膠囊、金蓮花顆粒、金蓮花口服液等中成藥中廣泛應(yīng)用，雖然其真?zhèn)舞b定及質(zhì)量評價方法研究較多，但《中國藥典》1985 年版至2020 年版未收錄，其臨床用藥的安全性和有效性等有待研究，因此，筆者呼吁盡快推進金蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)。