基因芯片技術(shù)在針灸領(lǐng)域的應(yīng)用和研究現(xiàn)狀*

韓 科，楊詠紅，樊小農(nóng)，王 舒，張俊清，牟 蛟，張 超，焦 洋，趙 帥，孟智宏△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.濟(jì)南市第五人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250000; 3.天津市針灸研究所天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193;4.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193)

綜述

基因芯片技術(shù)在針灸領(lǐng)域的應(yīng)用和研究現(xiàn)狀*

韓 科1，楊詠紅2，樊小農(nóng)3，王 舒4，張俊清1，牟 蛟1，張 超1，焦 洋1，趙 帥1，孟智宏4△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.濟(jì)南市第五人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250000; 3.天津市針灸研究所天津市針灸學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193;4.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193)

基因芯片技術(shù)在針灸機(jī)理研究中應(yīng)用越來(lái)越廣，與中醫(yī)針灸經(jīng)典理論相結(jié)合，從分子水平上全面而深刻的探究了針灸的作用機(jī)制，體現(xiàn)了針灸治病的整體調(diào)節(jié)作用。本研究從針灸的臨床和基礎(chǔ)研究的角度綜述了基因芯片技術(shù)在針灸領(lǐng)域中的應(yīng)用和取得的研究成果。

針灸;基因芯片;臨床應(yīng)用

基因芯片(gene chip)，又稱(chēng)DNA芯片，也常被稱(chēng)作DNA微陣列或DNA微陣列芯片，最早是由E.southern在1989年提出，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列在固象支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息［1］?；蛐酒夹g(shù)是基因功能研究中最偉大的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，它融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域的成就，具有其高通量、大規(guī)模、高度平行性、快速高效、高靈敏度、高度自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用研究已深入到醫(yī)學(xué)各生命學(xué)科中，當(dāng)然針灸也不例外。

目前，基因芯片技術(shù)已用于針灸領(lǐng)域的研究中，并積累了一定的資料。通過(guò)觀察不同經(jīng)脈的穴位、不同的干預(yù)方法等影響針刺效應(yīng)的因素，尋找出相關(guān)組織基因表達(dá)的差異。從分子水平上深化和發(fā)展了中醫(yī)對(duì)經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象、腧穴的特異性、經(jīng)脈－臟腑相關(guān)的認(rèn)識(shí)。為總結(jié)針灸領(lǐng)域研究應(yīng)用該技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)和成果，本文從臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究角度，對(duì)國(guó)內(nèi)近10年來(lái)基因芯片技術(shù)在針灸領(lǐng)域中的研究應(yīng)用評(píng)述如下。

1 基因芯片在針灸臨床應(yīng)用研究

針灸臨床療效在世界范圍內(nèi)被廣泛認(rèn)可，但針灸的治療疾病的科學(xué)機(jī)理研究至今尚未明了?；蛐酒夹g(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段，可以在一次試驗(yàn)中同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)基因進(jìn)行分析。針刺可引起人體多系統(tǒng)、多功能的同步變化，符合中醫(yī)治療疾病的整體觀念思想，因此通過(guò)觀察不同穴位、時(shí)間、頻率、刺激強(qiáng)度、刺激方法等導(dǎo)致有關(guān)組織基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)上的差異，從分子水平全面而深刻探明針刺的作用機(jī)制，體現(xiàn)針灸的整體調(diào)節(jié)作用［2］。

譚從娥等［3］選取典型腎陽(yáng)虛證患者10名給予溫針治療兩周，然后以其中療效最好的4例治療前后作基因芯片雜交測(cè)試，篩選出32個(gè)顯著表達(dá)基因，基因功能注釋結(jié)果提示炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)基因顯著表達(dá);分子通路主要集中于免疫及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。由此可以看出，溫針灸能通過(guò)影響多靶點(diǎn)和疾病過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)激發(fā)機(jī)體自身內(nèi)在的調(diào)整能力而達(dá)到治療目的，也提示溫針療效的生物學(xué)基礎(chǔ)是多方面的，涉及到炎癥反應(yīng)、免疫功能、信號(hào)系統(tǒng)等多方面的基因表達(dá)。楊麗萍等［4］在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，初步研究了得出腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生主要涉及13條免疫相關(guān)基因表達(dá)的異常，經(jīng)溫針治療前后的基因芯片比較結(jié)果顯示:NM000265、NM001838基因普遍上調(diào)，NM001784基因普遍下調(diào)，其他基因表達(dá)無(wú)規(guī)律性變化，初步認(rèn)為溫針灸可能通過(guò)誘導(dǎo)或阻遏和免疫相關(guān)的基因的表達(dá)發(fā)揮效應(yīng)。

丁漢榮等［5］篩選出符合西醫(yī)膝骨關(guān)節(jié)炎和中醫(yī)腎陽(yáng)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者兩組，每組8例，與8例正常對(duì)照組比較。結(jié)果顯示，兩張芯片各獲得162和75條差異表達(dá)基因，其中與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的分別為26條和11條;兩張芯片共同差異表達(dá)基因6條，與信號(hào)相關(guān)的有3條，占總數(shù)的1/2。試驗(yàn)結(jié)果差異表達(dá)基因涉及到多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最重要的有3條;JAK－STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過(guò)研究認(rèn)為，機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常特別是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)可能是腎陽(yáng)虛骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常也可能在腎陽(yáng)虛證骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

2 基因芯片在針灸基礎(chǔ)應(yīng)用研究

基因芯片技術(shù)在基礎(chǔ)研究中所選對(duì)象仍以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為主，現(xiàn)對(duì)針灸治療腦梗塞、潰瘍性結(jié)腸炎、急性心肌缺血、脊髓損傷、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病機(jī)理，以及經(jīng)穴臟腑相關(guān)性、抗衰老、抗腦缺氧機(jī)理進(jìn)行了研究。其中對(duì)抗衰老、腦梗塞、潰瘍性結(jié)腸炎、經(jīng)穴臟腑相關(guān)性機(jī)理研究較多。根據(jù)干預(yù)方法的不同，概括總結(jié)了基因芯片技術(shù)在上述疾病機(jī)理研究中運(yùn)用概況。

2.1 傳統(tǒng)針刺

王米渠等［6］應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究了針刺D－半乳糖所致衰老大鼠涌泉穴對(duì)衰老模型大鼠基因表達(dá)的影響，初步篩選出了318條差異表達(dá)基因，并對(duì)其中差異最為顯著的55條作了初步分析，結(jié)果表明了針刺對(duì)基因表達(dá)的影響涉及免疫、基礎(chǔ)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等多方面基因的表達(dá)。張衛(wèi)等［7］通過(guò)針刺亞急性衰老大鼠的涌泉穴，研究針刺對(duì)亞急性衰老大鼠蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步了解到針刺能夠調(diào)節(jié)衰老過(guò)程中與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)量，調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白質(zhì)的含量與組成比例，起到改善機(jī)體功能狀態(tài)延緩衰老的作用。丁曉蓉等［8］通過(guò)針刺快速老化小鼠(SAMP10)膻中、中脘、氣海、血海、足三里穴位，觀察到P10海馬共有7類(lèi)10個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，所有與SAMP10快速老化相關(guān)基因的表達(dá)均被部分或全部的逆轉(zhuǎn)。說(shuō)明針刺上述穴位能夠良性調(diào)節(jié)腦老化相關(guān)基因的表達(dá)，并可能通過(guò)該種作用延緩腦衰老。張占軍等［9］應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片篩選出局灶性腦缺血大鼠腦相關(guān)基因211個(gè)，其中12個(gè)基因低表達(dá)，199個(gè)基因高表達(dá)，它們中有相當(dāng)部分被證實(shí)為新的局灶性腦缺血相關(guān)基因。莊明華等［10］快針淺刺新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型的督脈穴(百會(huì)、天門(mén)、大椎和脊中)、任脈穴(關(guān)元、中腕、膻中和承漿)、膀胱經(jīng)穴(肺俞、心俞、脾俞和腎俞)14天后，大腦皮質(zhì)基因共有48條基因與對(duì)照組有表達(dá)差異，其中40條基因上調(diào)，8條基因下調(diào)，得出針刺對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠大腦皮質(zhì)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及受體基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，這可能介導(dǎo)了針刺治療缺血缺氧性腦病的分子機(jī)制。

2.2 艾灸

尹海燕等［11］選用艾灸百會(huì)和命門(mén)尋找與艾灸有關(guān)的老年學(xué)習(xí)記憶減退大鼠海馬干細(xì)胞相關(guān)的基因靶點(diǎn)，重點(diǎn)靶點(diǎn)可能主要在于Fgf、Tgf、Wnt和Sox家族。張燕等［12～13］艾灸18月齡wistar老年大鼠命門(mén)穴，顯示抗衰老的分子機(jī)制主要與炎性反應(yīng)基因有關(guān)，老年組/年輕組中上調(diào)的22條炎性反應(yīng)基因中有14條基因在灸療組/年輕組中正常表達(dá)，有5條基因在灸療組/年輕組中趨于正常表達(dá)，灸命門(mén)穴通過(guò)良性調(diào)節(jié)19條炎性反應(yīng)基因從而延緩老年大鼠衰老;而在大鼠衰老的抗氧化機(jī)制中老年組與年輕組中涉及氧和活性氧中間產(chǎn)物參與新陳代謝的過(guò)程的9條基因下調(diào)，經(jīng)過(guò)灸命門(mén)穴位治療后，有8條基因在灸療組與年輕組中正常表達(dá)，因此抗氧化可能是灸命門(mén)穴延緩老年大鼠衰老的機(jī)制之一。吳煥淦等［14］探討隔藥灸潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠“天樞”穴治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)理，篩選出在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸中異常表達(dá)、隔藥灸治療后得到調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因174條，其中28條(含已知基因7條)在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中表達(dá)下調(diào)的基因經(jīng)隔藥灸治療后表達(dá)升高，146條(已知基因42條)上調(diào)基因經(jīng)隔藥灸治療后表達(dá)降低。得出隔藥灸可通過(guò)調(diào)節(jié)IL－1βmRNA等諸多基因的表達(dá)，起到治療作用。楊馨等［15～16］觀察艾灸雙側(cè)“腎俞”，對(duì)實(shí)驗(yàn)性類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)家兔滑膜細(xì)胞JAK－STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路異常激活有明顯抑制作用，上述兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都直接或間接參與了體內(nèi)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，因此艾灸具有抗炎消腫的作用。

2.3 電針

曲怡等［17］用大鼠全基因組寡核苷酸微陣列芯片檢測(cè)電針“水溝”、“百會(huì)”穴對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果顯示局灶性腦缺血再灌注大鼠與假手術(shù)組大鼠腦組織基因表達(dá)譜相比，有175個(gè)差異表達(dá)基因，其中115個(gè)基因表達(dá)增高，60個(gè)基因表達(dá)下調(diào);電針組與局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織基因表達(dá)譜相比，有74個(gè)差異表達(dá)基因，其中26個(gè)基因表達(dá)增高，48個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些基因大多與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)代謝、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。李夢(mèng)等［18］從差異表達(dá)基因方面探討心經(jīng)經(jīng)脈、肺經(jīng)經(jīng)脈與下丘腦相關(guān)的特異性分子基礎(chǔ)，結(jié)果顯示，電針心經(jīng)與電針?lè)谓?jīng)比較，其在下丘腦中樞調(diào)節(jié)過(guò)程中具有相對(duì)特異性作用途徑。說(shuō)明經(jīng)脈與臟腑之間存在著相對(duì)特異性的聯(lián)系。陳慧群等［19］電針大鼠足三里穴調(diào)控胃運(yùn)動(dòng)的相關(guān)差異基因及其相關(guān)的部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)過(guò)速較胃動(dòng)過(guò)緩明顯差異表達(dá)的標(biāo)志基因hoxal、lep、bc－l上調(diào)，分別屬于維甲酸通路、胰島素通路、survival通路、雌激素通路、磷脂酶C通路;胃動(dòng)過(guò)速較胃動(dòng)過(guò)緩明顯差異表達(dá)的標(biāo)志基因ptgs2下調(diào)，屬于磷脂酶C通路。結(jié)果為電針足三里穴對(duì)大鼠胃電具有雙向調(diào)節(jié)作用，并以抑制作用為主。汪克明，吳子建等［20～21］揭示了電針對(duì)缺血心肌的保護(hù)機(jī)制和抗心肌缺血的分子作用途徑。陳澤斌等［22］探討針刺預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷作用的分子機(jī)制，分析得出20個(gè)基因表達(dá)差異具有顯著性意義(P＜0.05)。其中8個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)下調(diào);涉及神經(jīng)元信號(hào)傳遞類(lèi)(離子通道、遞質(zhì)、受體、第二信使)基因11個(gè)，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控類(lèi)基因5個(gè)，涉及代謝酶類(lèi)基因2個(gè)，涉及熱休克反應(yīng)類(lèi)基因1個(gè)，涉及細(xì)胞骨架類(lèi)基因1個(gè)。初步了解到針刺預(yù)處理后神經(jīng)細(xì)胞功能狀態(tài)的改變可能是其隨后發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用的重要基礎(chǔ)。有學(xué)者等［23～24］研究電針和針?biāo)幗Y(jié)合治療抑郁癥的作用機(jī)理，以及兩者的優(yōu)缺點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)抑郁癥模型大鼠下調(diào)表達(dá)，而經(jīng)電針治療后表達(dá)趨于正常的基因有101條，其中多條基因與能量和物質(zhì)代謝有關(guān)，還涉及蛋白質(zhì)生物合成和嗅覺(jué)感受器等;抑郁癥模型大鼠上調(diào)表達(dá)，而經(jīng)電針治療后表達(dá)趨于正常的基因有125條，其中多條基因與凝血、免疫、炎性反應(yīng)和凋亡相關(guān)。電針和針?biāo)幗Y(jié)合差異表達(dá)基因譜較為相似，針?biāo)幗Y(jié)合的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在強(qiáng)有效地下調(diào)凝血因子Ⅴ和5－羥色胺2C受體的表達(dá)說(shuō)明電針和針?biāo)幗Y(jié)合治療抑郁癥的機(jī)制與調(diào)控多條基因表達(dá)有關(guān)。

3 小結(jié)

綜上所述，基因芯片技術(shù)在針灸學(xué)中應(yīng)用越來(lái)越多，針灸治療作用機(jī)理的研究也取得了一定的成績(jī)。但目前研究所選用的對(duì)象仍然以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為主，人體試驗(yàn)相對(duì)較少，人體的經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象顯然不完全等同于動(dòng)物，因此，以人體為主要研究對(duì)象的研究應(yīng)引起重視。對(duì)針灸作用機(jī)理的研究，應(yīng)借鑒生命科學(xué)領(lǐng)域的先進(jìn)的理論及技術(shù)，從影響基因的調(diào)控、表達(dá)，特別是表達(dá)產(chǎn)物的功能著手，研究吸收“功能基因組學(xué)”研究成果的基礎(chǔ)上，充分發(fā)揮針灸擅于調(diào)節(jié)的特征，為針灸作用機(jī)理的闡述乃至經(jīng)絡(luò)俞穴本質(zhì)的最終揭示，發(fā)揮重要作用。在“功能基因組”與“疾病基因組”的調(diào)控方面，針灸具有巨大的潛力，如果能在該方面有突破的話，將使我國(guó)針灸領(lǐng)域的相關(guān)研究成果在即將來(lái)臨的“后基因時(shí)代”處于國(guó)際領(lǐng)先地位［25］。通過(guò)基因芯片的研究可能建立起不同針刺條件下，不同疾病的基因表達(dá)圖譜，有助于從基因水平分析和篩選不同經(jīng)脈相對(duì)特異性的基因，優(yōu)化臨床選穴標(biāo)準(zhǔn)，初步從分子水平上規(guī)范了臨床針灸的治療學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，為針刺的基礎(chǔ)和臨床研究提供更加科學(xué)的規(guī)范，更好的指導(dǎo)臨床，提高療效。

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［19］陳慧群，楊琦，王景杰，等.電針大鼠足三里穴調(diào)控胃運(yùn)動(dòng)的相關(guān)差異基因及部分信號(hào)通路研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8 (12):2250－2253

［20］汪克明，吳子建，胡玲，等.電針對(duì)大鼠急性缺血心肌細(xì)胞caspase基因的調(diào)控［J］.上海針灸雜志，2006，25(11):40－42

［21］吳子建，汪克明，王月蘭，等.電針對(duì)心肌缺血細(xì)胞G蛋白信號(hào)通路的影響［J］.針刺研究，2006，31(5):264－267

［22］陳澤斌，王華針.刺對(duì)大鼠腦組織神經(jīng)生物學(xué)基因表達(dá)的研究［J］.中國(guó)針灸，2005，25(8):573－575

［23］江勵(lì)華，徐斌，王玲玲.電針與電針合并氟西汀治療抑郁癥的基因譜表達(dá)異同的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(11):3000－3004

［24］江勵(lì)華，王玲玲.電針治療抑郁癥的全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析［J］.針刺研究，2010，35(2):83－89

［25］洪凈.中醫(yī)藥防治疾病的優(yōu)勢(shì)與學(xué)術(shù)發(fā)展初入點(diǎn)的探討［J］.中醫(yī)雜志，2002，41(12):751

Application and Research of Genechip Technology in the Field of Acupuncture

HAN Ke1，YANG Yong－h(huán)ong2，F(xiàn)AN Xiao－nong3，WANG Shu4，ZHANG Jun－qing1，MOU Jiao1，ZHANG Chao1，JIAO Yang1，ZHAO Shuai1，MENG Zhi－h(huán)ong4△
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2.Jinan Fifth People’s Hospital，Jinan 250000，China; 3.Tianjin Acupuncture and Moxibustion Institute，Tianjin Acupuncture and Moxibustion Key Laboratory，Tianjin 300193，China; 4.First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China)

Genechip technology is more widely applied in the mechanism of acupuncture combined with the classical theory of acupuncture.The paper explores the mechanism of acupuncture comprehensively and profoundly in the level of molecular and reflects the overall regulation of acupuncture treatment.This paper summarizes the application and research of genechip technology in the clinic and basic research field of acupuncture.

Acupuncture;Genechips;Clinical application

R246

A

1005－0779(2012)007－0067－03

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973計(jì)劃”)資助，編號(hào): 2010CB530506，2012CB518505。

韓科(1983－)，男，2009級(jí)針灸推拿專(zhuān)業(yè)博士研究生，主要從事針灸治療腦血管病的臨床和基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:孟智宏(1963－)，男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事心腦血管病的臨床和基礎(chǔ)研究。

2011－12－29