肺癌標(biāo)志物識別的蛋白質(zhì)組分析

丁燕 翻譯 曹志成 校對

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因。肺癌病變涉及許多基因突變和表觀遺傳學(xué)改變的復(fù)雜過程。識別反映啟動腫瘤進(jìn)展通路的分子標(biāo)志物或有助監(jiān)測腫瘤狀態(tài)。

檢測并定量蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組技術(shù)的改進(jìn)，為試圖對疾病進(jìn)行深入探索的研究人員創(chuàng)造了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合高等生物信息學(xué)被廣泛用于識別基于蛋白質(zhì)通路和信號級聯(lián)的癌癥分子標(biāo)志物[1]。肺癌特異性的蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)志物開始涌現(xiàn)。

在最近發(fā)表的一篇文章中，Taguchi等 對數(shù)個(gè)小鼠肺腫瘤模型中的血漿蛋白質(zhì)組與其它幾種腫瘤類型的血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行了對比，并識別出16種與肺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)。在EGF受體（EGFR）突變的肺腺癌模型中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)涉及EGFR的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，并在小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）模型中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與神經(jīng)內(nèi)分泌進(jìn)展明顯相關(guān)的血漿標(biāo)志物。隨后他們將該發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展至肺癌患者。其研究提示深入的定量蛋白質(zhì)組學(xué)或可反映肺腫瘤生物學(xué)。本文評價(jià)了該發(fā)現(xiàn)的意義和影響，并討論了本領(lǐng)域一些相關(guān)的研究。

方法及結(jié)果

在遺傳工程小鼠模型中利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Taguchi等比較了四種肺癌模型（EGFRL858R腺癌、KrasG12D腺癌、p53lox/loxSCLC以及Rblox/loxSCLC）與其它腫瘤類型（乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌以及前列腺癌）模型、兩種炎癥（急性和慢性）模型中的血漿蛋白質(zhì)的表達(dá)譜。研究鑒別出一些可反映肺腫瘤生物學(xué)的血漿蛋白質(zhì)譜，包括13種與肺腺癌特異性相關(guān)的蛋白質(zhì)，以及3種蛋白質(zhì)在肺癌中表達(dá)增加而在非肺腫瘤模型中卻未見增加。

編碼小鼠肺腺癌血漿中水平升高的四種蛋白質(zhì)的同源基因（SFTPB、SFTPD、NPC2以及WFDC2）與TITF1/NKX2-1 mRNA水平呈正相關(guān)。其中，在111個(gè)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）腫瘤中NPC2的表達(dá)與TITF1/NKX2-1 mRNA明顯相關(guān)。利用兩種肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)一步開展了TITF1/NKX2-1敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞株的TITF1/NKX2-1均呈高表達(dá)。在NSCLC腫瘤中，34種潛在的TITF1/NKX2-1調(diào)節(jié)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)與TITF1/NKX2-1 mRNA水平密切相關(guān)。

在EGFR突變和KRS突變肺腺癌小鼠模型以及SCLC小鼠模型中，生物反應(yīng)路徑分析（Ingenuity Pathway Analysis）發(fā)現(xiàn)了涉及EGFR的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)，對SCLC小鼠模型的血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)了33種與神經(jīng)疾病通路或神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)展及功能通路有關(guān)的蛋白質(zhì)。

EGFR突變小鼠模型中的血漿EGFR網(wǎng)絡(luò)包括六種直接與EGFR結(jié)合的蛋白質(zhì)（Met、Cd44、Cdh1、Ndn、Sh3bgrl以及Rin1）。有趣的是，僅在EGFR突變小鼠模型中觀察到Cd44（IPI00265503）的一種形態(tài)，而在KRS小鼠模型中未發(fā)現(xiàn)。對21種肺腺癌細(xì)胞株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在10種EGFR突變細(xì)胞株中，其中4種可見編碼CD44變異區(qū)的多肽，但在11種KRAS突變細(xì)胞株中均未觀察到。

對比厄洛替尼治療前后攜帶EGFRL858R轉(zhuǎn)基因荷瘤小鼠的血漿蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)了小鼠血清中表達(dá)改變的91種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平恢復(fù)到基線水平。利用這一方法，亦發(fā)現(xiàn)了EGFR模型中可反映腫瘤進(jìn)展和回歸的蛋白質(zhì)。

兩組NSCLC人血液樣本（診斷前0-11個(gè)月以及新近診斷的吸煙者）、一組SCLC人血漿樣本及其匹配的非腫瘤對照中，應(yīng)用ELISA方法對小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。在NSCLC患者中，EGFR水平降低，而SFTPB、WFDC2以及ANGPTL3水平升高。在擬診斷樣本組，該四種蛋白質(zhì)聯(lián)合的曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.808，新近診斷組的AUC為0.882。靶向于ROBO1外功能區(qū)的ELISA檢測亦顯示，與NSCLC患者及非腫瘤對照血漿中的水平相比，SCLC人血漿中ROBO1水平顯著升高。人肺癌樣本所得結(jié)果與來自小鼠模型的發(fā)現(xiàn)完全吻合。

討論

蛋白質(zhì)濃度是動態(tài)變化的，且有時(shí)會隨著應(yīng)激、疾病或治療發(fā)生明顯改變[3]。對有機(jī)體的蛋白質(zhì)組進(jìn)行檢測就好像在某一時(shí)間點(diǎn)對其活動進(jìn)行“快照”。這可能會低估或錯(cuò)失其余時(shí)間發(fā)生的過程的重要性。由于個(gè)體的異質(zhì)性，Taguchi等選擇基因工程小鼠模型對肺癌蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究是非常明智的。事實(shí)上，他們的研究不僅廣泛探索了不同組織類型肺癌模型的蛋白質(zhì)組，而且通過可靠的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了一些已發(fā)現(xiàn)的重要蛋白質(zhì)，這為蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證樹立了新的榜樣。

該研究采用了許多攜帶有不同肺癌類型以及不同腫瘤類型的小鼠模型。盡管如此，為強(qiáng)調(diào)腫瘤進(jìn)展中的轉(zhuǎn)化變化，應(yīng)納入良性和轉(zhuǎn)移性肺癌腫瘤模型[4]。他們也應(yīng)用了兩種炎癥小鼠模型，目前小鼠模型仍是探討炎癥在肺癌進(jìn)展中作用的熱點(diǎn)[5]。該研究所應(yīng)用的急性、慢性炎癥動物模型有助于我們理解癌癥和炎癥模型之間的區(qū)別。為對肺癌進(jìn)展有更明確的了解，納入肺相關(guān)炎性疾?。ㄈ纾郝宰枞苑渭膊。┑男∈竽Ｐ蛷亩鴮Ψ伟?fù)雜的微環(huán)境進(jìn)行更為徹底的研究或許更好[6]。

盡管每組小鼠血漿均受到三種最為豐富的蛋白質(zhì)（白蛋白、IgG以及轉(zhuǎn)鐵蛋白）通過多重親和去除系統(tǒng)-3的免疫清除，一些已證實(shí)與肺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)在肺腺癌小鼠模型中并未被發(fā)現(xiàn)。作者解釋為質(zhì)譜分析靈敏度不足或這些蛋白質(zhì)在腫瘤進(jìn)展早期并未明顯升高，需要更敏感的平臺以改善檢測性能。血清淀粉樣蛋白A作為另一廣泛存在的肺癌潛在生物標(biāo)志物在研究所用的所有小鼠模型中均有發(fā)現(xiàn)但未被量化，該蛋白質(zhì)值得量化，因?yàn)樗蛟S是肺癌的潛在生物標(biāo)志物[7]。

為驗(yàn)證小鼠模型中所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)與人肺癌是否相關(guān)，該研究分析了自小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的四種蛋白質(zhì)的組合用以檢測26例擬診斷和28例新近診斷的人NSCLCs的潛在價(jià)值。他們的發(fā)現(xiàn)不僅驗(yàn)證了小鼠與人肺癌血漿蛋白質(zhì)變化的一致性，而且也提示這一組合的明顯變化可作為肺癌早期診斷的微創(chuàng)NSCLC特異性生物標(biāo)志物。大型前瞻性多中心試驗(yàn)或許有助于該組合標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。

專家評論及5年展望

早期診斷有助于改善肺癌患者的生存，因此發(fā)現(xiàn)早期診斷生物標(biāo)志物非常有意義[8]。該研究結(jié)果顯示對小鼠模型的蛋白質(zhì)表達(dá)的定量對比分析將有助于研究擬診斷和新近診斷的人NSCLCs。事實(shí)上，定量對比蛋白質(zhì)組學(xué)方法用途極廣，可以揭示許多問題。例如，Wei等利用該方法在肺腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了用于多藥耐藥和放療抵抗的蛋白質(zhì)標(biāo)志物[9]。他們共鑒定出四種表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)（HSPB1、波形蛋白、cofilin-1和膜聯(lián)蛋白A4），這些蛋白質(zhì)可作為預(yù)測人肺腺癌對化療和放療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。

目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物對個(gè)別癌癥類型來說并非十分特異，這限制了它們在個(gè)別癌癥篩查中的應(yīng)用。該項(xiàng)研究在已定量血漿蛋白質(zhì)中成功應(yīng)用聚類分析以揭示不同癌癥類型中多種模型的聚類。該方法或有助于克服生物標(biāo)志物腫瘤類型特異性的挑戰(zhàn)。

新近大量基因研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括不同信號通路在內(nèi)的癌癥標(biāo)志[10]。該研究分析了NSCLC及SCLC模型中的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。突變EGFR肺癌模型血漿中EGFR網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)或許揭示了驅(qū)動肺腫瘤進(jìn)展的基因和通路，而SCLC模型中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶體通路或可為SCLC提供潛在的神經(jīng)內(nèi)分泌靶標(biāo)。事實(shí)上，研究已證實(shí)功能蛋白質(zhì)組學(xué)是通路分析的可行方法。通過在肺癌中進(jìn)行功能性磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Sudhir等發(fā)現(xiàn)了Ras信號通路中的一些潛在靶標(biāo)[11]，他們的研究發(fā)現(xiàn)了可由致癌性Ras調(diào)控的磷酸化過程、信號網(wǎng)絡(luò)和分子功能，應(yīng)有助于開拓我們對肺癌中Ras信號的認(rèn)識。Remily-Wood等利用液相色譜法串聯(lián)多級反應(yīng)檢測質(zhì)譜分析法以及GeneGO MetaCoreTM的通路地圖以明確蛋白質(zhì)之間的生物關(guān)系并闡明多元化分析的理念[12]，他們最終研發(fā)了定量分析數(shù)據(jù)庫（Quantitative Assay Database）[101]，實(shí)踐了癌癥中信號通路和生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)組的定量分析。在不遠(yuǎn)的將來，國際聯(lián)盟和更多開放存取的數(shù)據(jù)庫將成為現(xiàn)實(shí)。腫瘤生物學(xué)的探索正在涌現(xiàn)。

動物模型為轉(zhuǎn)化研究架起了橋梁[13]。該研究將小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)與人體臨床樣本的驗(yàn)證整合，這或可加速潛在的生物標(biāo)志物用于NSCLC早期診斷的臨床實(shí)踐的成功。在未來5年內(nèi)，我們預(yù)測多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物將被用于腫瘤早期診斷。經(jīng)大規(guī)模前瞻性多中心驗(yàn)證后，蛋白質(zhì)組學(xué)分析所支持的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)將邁向臨床實(shí)踐[14]。

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關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)

· 在肺腺癌小鼠模型中，深入的定量蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了Titf1/Nkx2-1血漿蛋白質(zhì)組。

· 血漿蛋白質(zhì)標(biāo)志物可反映肺癌的分子水平不同的亞型并反映肺腫瘤生物學(xué)。

· 在EGF受體突變模型中發(fā)現(xiàn)了一涉及EGF受體的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，并且在小細(xì)胞肺癌模型中發(fā)現(xiàn)了一種不同的與神經(jīng)內(nèi)分泌進(jìn)展相關(guān)的血漿標(biāo)志物。

· 血漿蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)揭示了一些可驅(qū)動腫瘤進(jìn)展的基因。

· 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物與人肺癌樣本的ELISA結(jié)果一致。

· 對比四種肺癌小鼠模型與乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和前列腺癌模型及兩種炎癥模型的血漿蛋白質(zhì)譜，在小鼠模型的血漿中共發(fā)現(xiàn)16種肺癌特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物。