前列安通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉 勇 韓桂茹 趙志軍 安麗娜

(河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051)

前列安通膠囊為前列安通片［1］的改劑型產(chǎn)品，由黃柏、赤芍藥、丹參、澤蘭、桃仁、烏藥、王不留行和白芷組成。改劑型后，處方不變，將片劑制成膠囊劑。根據(jù)國家對改劑型品種的要求，重新對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高和簡化研究，增訂了丹參的薄層鑒別，并對原黃柏和赤芍藥的薄層鑒別進(jìn)行了修訂，采用同一樣品溶液，將3味藥材調(diào)整在同一塊薄層板上檢出。還將丹參中含量低微的單一原兒茶醛［2］定量測定修訂為高含量的鹽酸小檗堿［3］及丹酚酸 B［3］，方法簡便、快捷、實(shí)用，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 日本島津高效液相色譜(HPLC)儀，配有LC－20 AT泵、SPD－M20A二極管陣列檢測器、LC－solution色譜工作站;色譜柱:迪馬 dimonsil色譜柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)。

1.1.2 藥品與試劑 前列安通膠囊(批號 050301、11548001、11548002、11548003)及處方中藥材由承德燕峰藥業(yè)股份有限公司提供;對照藥材:丹參(批號120923－200006)、黃柏(批號 121510－200703)、赤芍藥(批號121092－200402)，鹽酸小檗堿(批號 110713－200911，含C20H18ClNO486.8%)，丹酚酸 B(批號111562－200302)均購自中國藥品生物制品檢定所。流動(dòng)相所用乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑、試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取前列安通膠囊內(nèi)容物1 g，加甲醇5 mL，超聲處理6 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g，赤芍藥和丹參對照藥材各0.3 g，分別加甲醇3 mL，超聲處理6 min，取上清液作為對照藥材溶液。吸取上述4種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(12∶2∶1∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與黃柏對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。再噴以5%香草醛硫酸溶液－乙醇(1∶6)混合溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下隨即觀察。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與丹參和赤芍藥對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含黃柏，或赤芍藥，或丹參的樣品)無干擾(見封3，圖1、2)。

2.2 鹽酸小檗堿含量測定 黃柏系指川黃柏，為前列安通膠囊處方中的君藥，主含鹽酸小檗堿，為抗菌消炎、清熱解毒的有效成分，且含量比較高，又是以藥材原粉的形式加入，其質(zhì)量的好壞對產(chǎn)品質(zhì)量具有舉足輕重的作用，所以對黃柏的有效成分進(jìn)行了含量測定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相:乙腈－甲醇－0.1%磷酸(17∶13∶70);檢測波長:265 nm;柱溫:40℃;流速:1.0 mL/min;理論板數(shù):按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加含0.2%鹽酸的70%甲醇溶液制成每 mL含12 μg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下的前列安通膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加含0.2%鹽酸的70%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，用含0.2%鹽酸的70%甲醇溶液，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.2.2.3 空白樣品制備 取不含黃柏的樣品，按2.2.2.2項(xiàng)下制備方法，制備空白樣品溶液。

2.2.3 樣品的測定 取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL，分別注入HPLC儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定，觀察空白樣品在鹽酸小檗堿峰保留時(shí)間處有無干擾。以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，對照品溶液與供試品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，空白樣品無干擾，見圖3、4、5，含量測定專屬。3批前列安通膠囊樣品中鹽酸小檗堿含量為5.74～5.84 mg/粒，RSD 為 0.65% ～0.75% ，見表 1。

表1 前列安通膠囊中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果

圖3 鹽酸小檗堿對照品HPLC圖

圖4 前列安通樣品HPLC圖

圖5 空白樣品HPLC圖

2.2.4 測定波長選擇 以波長265 nm作為測定波長。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取每 mL含鹽酸小檗堿0.012 6 mg的溶液，分別進(jìn)樣 2、5、10、15、20 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程?；貧w方程為:Y=4 560 820.7X－3 366，r=0.999 999。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.025 2～0.252 0 μg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖6。

圖6 鹽酸小檗堿線性關(guān)系圖

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取每mL含鹽酸小檗堿0.012 6 mg的對照品及相應(yīng)的供試品溶液，各進(jìn)樣5次，每次8 μL，測定鹽酸小檗堿峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿平均峰面積為453 528，RSD=0.89%;供試品中鹽酸小檗堿平均峰面積為386 497，RSD=0.19%。說明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.6項(xiàng)下對照品溶液及供試品溶液，繼續(xù)每隔6 h向HPLC儀進(jìn)樣，考察樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，對照品鹽酸小檗堿RSD=0.92%，供試品RSD=0.26%。說明對照品及供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取已知含量的同一批前列安通膠囊9份(批號11548002)，每份0.03 g，按高、中、低劑量，加上一定量的對照品，2.2.2.2 項(xiàng)下，進(jìn)行提取、制備、測定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿平均回收率為99.60%，RSD=0.69%。見表2。

表2 樣品中鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 以高、中、低劑量，取同一批前列安通膠囊(批號:11548002)9 份，按 2.2.2.2 及 2.2.1 項(xiàng)下，進(jìn)行提取、制備、測定，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿平均含量為16.32 mg/g，RSD=0.57%。說明方法重現(xiàn)性良好。見表3。

表3 鹽酸小檗堿含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 非緩沖鹽流動(dòng)相體系在含鹽酸小檗堿藥材中的應(yīng)用 采用含量測定方法中的非緩沖鹽流動(dòng)相體系，還對黃柏、黃連中的鹽酸小檗堿進(jìn)行了定量測定。結(jié)果顯示，本流動(dòng)相對2種藥材中的鹽酸小檗堿波峰也分離良好。見圖 7、8。

圖7 黃柏藥材HPLC圖

圖8 黃連藥材HPLC圖

2.3 丹酚酸B含量測定 丹參為前列安通膠囊處方中的主藥，提取工藝為水提取。其脂溶性有效成分以丹參酮ⅡA為指標(biāo)，水溶性成分以丹酚酸B為指標(biāo)。故本制劑為與《中華人民共和國藥典》的測定指標(biāo)一致，測定制劑中的丹酚酸B含量，以控制提取工藝的穩(wěn)定性及制劑質(zhì)量。

2.3.1 色譜條件 色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相:乙腈－甲醇－甲酸－水(10∶30∶1∶59);檢測波長:238 nm;柱溫:室溫;流速:1.0 mL/min;理論板數(shù):按丹參酚酸B峰計(jì)算不低于2 000。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加甲醇配制成原液，再取一定量原液，加50%甲醇制成每mL含丹參酚酸B 0.02 mg溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下前列安通膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加50%甲醇18 mL，超聲處理3 min，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2.3 空白樣品制備 取不含丹參的樣品，按2.3.2.2項(xiàng)下制備方法，制備空白樣品溶液。

2.3.3 樣品測定 取上述對照品、供試品及空白溶液各10 μL，分別注入 HPLC 儀，按照 2.3.1 項(xiàng)下色譜條件測定，觀察空白樣品在丹酚酸B峰保留時(shí)間處有無干擾。以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，對照品溶液與供試品溶液色譜峰保留時(shí)間一致，空白樣品無干擾，見圖9、10、11，含量測定專屬。3批前列安通膠囊樣品中丹酚酸 B 含量為 1.32～1.41 mg/粒，RSD 為 1.09% ～1.21%，見表 4。

表4 前列安通膠囊中丹酚酸B含量測定結(jié)果

圖9 丹酚酸B對照品HPLC圖

圖10 前列安通樣品HPLC圖

2.3.4 測定波長選擇 采用 SPD－M20A二極管陣列HPLC儀，對丹酚酸B對照品和前列安通樣品中相應(yīng)色譜峰分別進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果顯示，丹酚酸B有4個(gè)吸收峰，分別在238 nm、254 nm和288 nm、238 nm和288 nm處波峰最靈敏，且對照品與供試品波峰基本一致，因此采用最靈敏的波峰238 nm為測定波長。

圖11 空白樣品HPLC圖

2.3.5 線性關(guān)系考察 取每mL含0.054 3 mg丹酚酸B溶液，分別進(jìn)樣 2、4、8、16、25、30 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程?；貧w方程為:Y=1 395 836.5X+4006，r=0.999 992。結(jié)果顯示，丹酚酸 B 進(jìn)樣量在0.108 6 ～1.629 μg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖12。

圖12 丹酚酸B線性關(guān)系圖

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取每mL含21 μg丹酚酸B的對照品及相應(yīng)供試品溶液，各進(jìn)樣5次，每次20 μL，測定丹酚酸B峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，丹酚酸B平均峰面積為775 229，RSD=0.46%;供試品中丹酚酸B平均峰面積為625 332，RSD=0.59%。說明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.6項(xiàng)下對照品溶液及供試品溶液，繼續(xù)每隔5 h向HPLC儀進(jìn)樣，考察樣品12 h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，對照品丹酚酸B RSD=0.46%，供試品RSD=0.41%。說明對照品及供試品12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以高、中、低劑量，取同一批前列安通膠囊(批號050301)樣品 9 份，按 2.3.1 及 2.3.2.2 項(xiàng)下，進(jìn)行提取、制備、測定，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，丹酚酸B平均含量為2.14 mg/g，RSD=0.53%。說明方法重現(xiàn)性良好。見表5。

表5 丹酚酸B含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取已知含量同一批前列安通膠囊(批號050301)樣品9份，每份0.06 g，按高、中、低劑量，加一定量丹酚酸 B，按 2.3.2.2 項(xiàng)下，進(jìn)行提取、制備、測定、計(jì)算回收率。丹酚酸B平均回收率為99.12%，RSD=0.48% 。見表 6。

表6 樣品中丹酚酸B回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 本研究采用同一簡單的甲醇超聲樣品與對照藥材溶液，在同一塊薄層板上，在不同的檢視條件下同時(shí)鑒別了黃柏、赤芍藥和丹參藥材。方法簡便，斑點(diǎn)清晰，丹參的櫻紅色斑點(diǎn)等為首次報(bào)道。

3.2 文獻(xiàn)報(bào)道，鹽酸小檗堿的含量測定方法有HPLC法［4］、分光光度法［5］及薄層掃描法［6］等。使用頻率最高的是HPLC法。目前，生物堿類的HPLC測定，如苦參堿、氧化苦參堿、麻黃堿、馬錢子堿、烏頭堿等，其流動(dòng)相基本都是緩沖鹽體系，不僅流動(dòng)相的配制麻煩，在流動(dòng)相中還要添加十二烷基硫酸鈉，或磺酸鈉，或四氫呋喃等物質(zhì)［3，7］，溶質(zhì)增多，密度增大，壓力增高，很易損壞色譜柱與儀器檢測系統(tǒng)。在色譜柱沖洗過程，稍有不慎色譜柱的柱效降低很快，波峰發(fā)生變形。測定完畢后，色譜柱的沖洗過程也比較麻煩。本研究為克服上述弊端，通過探討，首次建立了采用非緩沖鹽流動(dòng)相體系，測定藥材及制劑中鹽酸小檗堿含量，方法簡便快捷，波峰分離良好。非緩沖鹽流動(dòng)相體系的探討成功，結(jié)束了鹽酸小檗堿測定的緩沖鹽時(shí)代，延長了色譜柱的使用壽命，為生物堿類的快捷、無污染、低成本測定發(fā)揮了重要作用。

3.3 前列安通膠囊提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與原標(biāo)準(zhǔn)比較，增加了君藥黃柏的含量測定，含量限度定為鹽酸小檗堿不得少于4.8 mg/粒。并將丹參中含量低微的指標(biāo)成分原兒茶醛不得少于0.018 mg/粒，修訂為高含量的有效成分丹酚酸B不得少于1.0 mg/粒。以君、臣藥中高含量有效成分為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制，有效提高了含量測定實(shí)際意義。

［1］ 國家藥品食品監(jiān)督管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編:外科婦科分冊［M］.2002:100.

［2］ 韓桂茹，張少杰，姚振林，等.丹七片中4種成分的HPLC定量測定［J］.中成藥，2005，27(11):1259－1263.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版:一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:286－287，70－71，300－301.

［4］ 周家才，梁玉梅，邱震.HPLC法測定雙黃消炎片中鹽酸小檗堿的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2009，13(3):267－269.

［5］ 王大杰.熒光分光光度法測定小檗堿的含量［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，24(4):262－264.

［6］ 楊輝.TLCS法測定復(fù)方黃連顆粒中鹽酸小檗堿的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10(1):25－26.

［7］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn).YBZ 06102009［S］.