高效液相法測定恒古骨傷愈顆粒中橙皮苷含量

羅 標

(河北省藥品認證審評中心，河北 石家莊 050091)

恒古骨傷愈顆粒是由陳皮、紅花、三七、杜仲、人參、黃芪、洋金花、鉆地風、鱉甲9味中藥加工而成的復方制劑，有活血益氣、補益肝腎、接骨續(xù)筋、消腫止痛及促進骨折愈合等功效，臨床上主要用于新鮮骨折及陳舊骨折、股骨頭壞死、骨關(guān)節(jié)病、腰椎間盤突出癥等病的治療［1］。為有效控制藥品質(zhì)量，筆者利用高效液相色譜(HPLC)法對陳皮中主要成分橙皮苷的含量進行測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Aglient 1100 HPLC儀(包括四元泵、紫外檢測器、自動進樣器)(美國安捷倫)，電子分析天平(Metters AE－163)(瑞士梅特勒)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品及試劑 恒古骨傷愈顆粒(安國市天下康制藥股份有限公司，批號080801、080802、080803)，橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110721－200512);乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 C18柱(Shimadzu ODS，4.6 mm ×150 mm，5 μm)，以乙腈－0.1% 磷酸溶液(19∶81)為流動相，檢測波長為283 nm，流速為1 mL/min，柱溫為室溫。此條件下色譜峰峰形對稱，分離度良好，理論板數(shù)按橙皮苷峰計算，應不低于5 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成每mL含橙皮苷50 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項下的恒古骨傷愈顆粒，研細，取0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性溶液制備 按恒古骨傷愈顆粒處方配比，取去除陳皮的其他藥味，按2.2.2項下方法制備陰性溶液。

2.3 專屬性試驗 分別取對照品、供試品及陰性溶液10 μL，按照2.1項色譜條件下進樣測試。結(jié)果表明，陰性色譜中在橙皮苷相應保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他藥味不干擾橙皮苷的檢出。見圖1、2、3。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.103 5 mg/mL 的橙皮苷對照品溶液 1、2、5、10 μL，濃度為 0.190 0 mg/mL的橙皮苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。計算得回歸方程。回歸方程為橙皮苷 Y=1 763.184 8X－0.340 1，r=0.999 8。結(jié)果顯示，橙皮苷進樣量在0.103 5～1.900 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖4。

圖1 橙皮苷對照品溶液HPLC圖

圖2 供試品溶液HPLC圖

圖3 缺陳皮陰性對照溶液HPLC圖

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液10 μL，分別在0、0.5、2、5、7.5、15 h 向高效液相色譜儀進樣，考察樣品15 h穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，橙皮苷峰平均峰面積為859.172，相對標準偏差(RSD)=0.99%，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖4 橙皮苷線性關(guān)系圖

2.6 重復性試驗 取同一批樣品，分別精密稱取0.32、0.40、0.48 g各3 份，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進行測定，計算RSD。結(jié)果顯示，橙皮苷平均含量為3.142 2 mg/g，RSD=0.32%，表明重復性良好。見表1。

表1 橙皮苷重復性試驗結(jié)果

2.7 回收率試驗 精密稱取已知含量(3.142 2 mg/g)的恒古骨傷愈顆粒0.2 g，精密加入3種不同濃度的橙皮苷對照品甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。按2.1項色譜條件進行測定，計算回收率。結(jié)果顯示，橙皮苷平均回收率為98.80%，RSD=0.95%，表明回收率良好。見表2。

表2 橙皮苷回收率試驗結(jié)果

2.8 含量測定 分別取取恒古骨傷愈顆粒樣品3批，按2.2.2 項下制備供試品溶液，精密吸取 10 μL，按 2.1 項色譜條件進樣測定橙皮苷，計算即得。見表3。

表3 橙皮苷含量樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 恒古骨傷愈顆粒處方中藥味較多，成分復雜，因此對樣品分離條件要求較高，以往研究中曾采用不同比例的乙腈－0.1%磷酸、甲醇－0.1% 磷酸［2－3］進行測定，結(jié)果以本研究所選比例橙皮苷與其他雜質(zhì)峰分離較好。

3.2 含量測定供試品溶液制備時曾對提取溶液與提取方式、提取時間進行考察，結(jié)果表明以甲醇為溶劑，超聲處理30 min即可提取完全，操作簡便。

3.3 對4種色譜柱進行考察(Agilent Zorbax、Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ、Venusil ASB C18、5umWaters Symmetry C18)，均能達到基線分離，表明本法有較好耐用性。

［1］常敏.恒古骨傷愈合劑治療股骨頭壞死189例臨床報告［J］.中華現(xiàn)代中醫(yī)雜志，2006，2(3):235－237.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標準匯編:骨傷科分冊［S］.2002:320.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005版:一部［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:132.