宮內(nèi)感染HBV嬰兒免疫失敗與IL-2、IFN-γ表達(dá)的相關(guān)性研究①

梅 燕 廖 滔 鄧新瓊 唐 玲 蔡 稔 (廣西柳州市婦幼保健院婦產(chǎn)科，柳州545001)

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白聯(lián)合阻斷乙型肝炎病毒母嬰傳播的作用已十分肯定，但近年來(lái)仍有10%～20%的母嬰傳播阻斷失敗。乙肝病毒宮內(nèi)感染是新生兒出生后乙肝疫苗接種失敗的主要原因。如何降低宮內(nèi)感染HBV免疫失敗率是目前國(guó)內(nèi)外專家致力的方向，其中細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與宮內(nèi)感染HBV接種乙肝疫苗失敗的關(guān)系是他們研究的熱點(diǎn)話題。白介素2(Interleukin-2，IL-2)是1976年Morgan等人用植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(Con A)等刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種因子，它主要是由 CD4+細(xì)胞產(chǎn)生，能直接刺激T細(xì)胞增殖，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，并且能誘導(dǎo)產(chǎn)生γ-干擾素，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞因子受體表達(dá)和產(chǎn)生新型的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)［1］，對(duì)HBV的免疫清除有賴于正常的IL-2產(chǎn)生和IL-2R的表達(dá)，IL-2分泌異常時(shí)，細(xì)胞免疫功能發(fā)生障礙［2］。本研究探討宮內(nèi)感染HBV嬰兒免疫失敗與外周血單核細(xì)胞不同刺激下細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平的相關(guān)性，從而探討免疫失敗的原因及可能有效的預(yù)防措施，為降低免疫失敗和慢性HBV攜帶狀態(tài)的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象及分組 選擇2007年7月至2008年7月廣西柳州市婦幼保健院產(chǎn)科住院無(wú)癥狀的乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性孕婦分娩的新生兒50例，其在出生后立即肌內(nèi)注射200 U乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，并于出生時(shí)、1個(gè)月、6個(gè)月分別注射酵母重組乙型肝炎疫苗，每次10 μg，出生后7個(gè)月時(shí)進(jìn)行隨訪抽取靜脈血檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物及HBV-DNA。20例HBV血清學(xué)標(biāo)志物均為陰性的孕婦分娩的嬰兒作為正常對(duì)照組。研究組病例孕期均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)血清 HBsAg和(或)HBeAg陽(yáng)性，孕婦自孕28周起肌內(nèi)注射 HBIG，分別于28、32、36周各肌注200 U HBIG;(2)血清甲、丙、丁、戊、庚等肝炎系列檢查呈陰性;(3)孕期未使用其他研究藥物、抗病毒藥物、細(xì)胞毒性藥物或皮質(zhì)類固醇激素類藥物;(4)無(wú)其他產(chǎn)科并發(fā)癥及合并癥(如胎膜早破、先兆早產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、妊娠高血壓等);(5)肝、腎功能正常;(6)孕期無(wú)明顯感染性疾病(如陰道炎及TORCH感染、艾滋病、梅毒等);(7)B超排除胎兒畸形。所有病例均排除父親有乙肝病史?？偣?0例孕婦共分娩70例新生兒。HBsAg陽(yáng)性孕婦分娩的嬰兒和正常對(duì)照組新生兒出生時(shí)的體重、Apgar評(píng)分、性別及分娩時(shí)胎齡、分娩方式比較，均無(wú)明顯差異。

1.1.2標(biāo)本采集及處理 在嬰兒家屬知情同意下，出生7個(gè)月時(shí)，抽取70例嬰兒靜脈血2 ml裝肝素抗凝管留作試驗(yàn)用，50例研究組嬰兒多抽取3 ml做乙肝標(biāo)志物檢測(cè)及HBV-DNA定量。

1.1.3主要耗材與儀器 耗材：Hank＇s液、淋巴細(xì)胞分離液、10%小牛血清的RPMI1640、0.2%臺(tái)盼蘭染液、計(jì)數(shù)板、植物血凝素、酵母重組 HBsAg、IFN-γ和IL-2 ELISA試劑盒。儀器：4℃低溫離心機(jī)、倒置顯微鏡、自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀。

1.2方法

1.2.1PBMC的分離、刺激和培養(yǎng) 常規(guī)分離PBMC，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，取等量的細(xì)胞懸液與0.2%臺(tái)盼蘭染液混合，計(jì)算出活細(xì)胞百分率達(dá)95%以上。將外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液等量分成3份置于不同的培養(yǎng)瓶中，分別加入PHA(終濃度為10 μg/ml)，酵母重組HBsAg(終濃度設(shè)置為 2.5 μg/ml)，RPMI1640(設(shè)為無(wú)刺激組)。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)(h)。

1.2.2細(xì)胞因子定量 采用ELISA法。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行培養(yǎng)液的上清液中IFN-γ和IL-2水平檢測(cè)。ELISA步驟完成以后，記錄吸光度(OD)，分別以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上根據(jù)樣品的吸光度找到相對(duì)應(yīng)的樣品的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用中位數(shù)(M)描述，不同組間的比較采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H法)，兩兩比較采用擴(kuò)展t檢驗(yàn)法。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1上清液IFN-γ水平的比較 采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2水平，非特異性刺激源(絲裂原)刺激誘導(dǎo)免疫反應(yīng)時(shí)三組IFN-γ、IL-2分泌均增加，但3組比較無(wú)顯著性差異(P=0.058;P=0.408)。在無(wú)刺激誘導(dǎo)時(shí)，免疫失敗組較免疫有效組和正常對(duì)照組IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重組HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3組比較均有顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失敗組增加最明顯，免疫失敗組和對(duì)照組差異有非常顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 嬰兒PBMC培養(yǎng)液的上清液IFN-γ、IL-2水平的比較(μg/ml)Tab．1 Levels of IFN-γ，IL-2 in newbaby PBMC culture suspension clear liquid(μg/ml)

2.2IL-2和IFN-γ的關(guān)系 在HBsAg刺激時(shí)IL-2和IFN-γ分泌呈正相關(guān)(r=0.335，P=0.005)。

3 討論

乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白聯(lián)合阻斷是降低HBV母嬰傳播的一項(xiàng)非常有效的措施，但近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道仍有10%～20%的發(fā)生免疫失敗，宮內(nèi)感染是其主要原因。袁榮等［3］研究認(rèn)為宮內(nèi)感染HBV并侵犯PBMC，使其IL-2分泌能力下降，可能是導(dǎo)致新生兒免疫接種失敗的機(jī)制之一。

本課題采用體外細(xì)胞培養(yǎng)和ELISA技術(shù)對(duì)18例宮內(nèi)感染HBV免疫失敗嬰兒、32例宮內(nèi)感染有效嬰兒及20名正常嬰兒外周血單個(gè)核細(xì)胞分別在絲裂原(植物血凝素)、酵母重組HBsAg刺激時(shí)γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2的分泌進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)非特異性刺激源(絲裂原)刺激誘導(dǎo)免疫反應(yīng)時(shí)3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，但3組比較無(wú)顯著性差異，說(shuō)明對(duì)非特異性刺激源均存在細(xì)胞免疫反應(yīng)，且不產(chǎn)生免疫耐受。在酵母重組HBsAg刺激誘導(dǎo)時(shí)，免疫失敗組較免疫有效組和正常對(duì)照組IL-2、IFN-γ的分泌低下。在酵母重組 HBsAg 2.5 μg/ml刺激下，3組IL-2、IFN-γ分泌均有增加，3組比較均有顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。免疫失敗組增加最明顯，免疫失敗組和對(duì)照組差異有非常顯著性差異(P＜0.01;P＜0.01)。在HBsAg刺激時(shí) IL-2和IFN-γ分泌呈正相關(guān)(r=0.335，P=0.005)。

宮內(nèi)感染免疫失敗的兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對(duì)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性增殖反應(yīng)低下，IL-2產(chǎn)生和 IL-2受體表達(dá)不足，機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)［4，5］。有研究認(rèn)為新生兒在T細(xì)胞水平對(duì)HBV抗原的耐受程度與抗-HBs的產(chǎn)生滴度相關(guān)，這表明HBV宮內(nèi)感染新生兒的免疫耐受大多是不完全的，通過(guò)使用細(xì)胞因子、免疫佐劑等方法部分可以消除或逆轉(zhuǎn)，當(dāng)耐受狀態(tài)逐漸消除或逆轉(zhuǎn)后方可產(chǎn)生免疫應(yīng)答。HBsAg是一種胸腺依賴性抗原，它誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗-HBs必須經(jīng)過(guò)抗原的提呈、輔助性T淋巴細(xì)胞的識(shí)別和B淋巴細(xì)胞的激活與分化，另外還需要多種免疫細(xì)胞與分子的共同參與。在這個(gè)復(fù)雜過(guò)程中任一步驟出現(xiàn)問(wèn)題，都可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)乙肝疫苗應(yīng)答水平低下或無(wú)應(yīng)答。根據(jù)近年來(lái)的研究，乙肝免疫球蛋白是通過(guò)增加Th1型細(xì)胞的活化，促進(jìn)體內(nèi)干擾素-γ、白細(xì)胞介素12的分泌達(dá)到清除新生兒體內(nèi) HBV的目的，并降低其體內(nèi)HBV-DNA含量，從而有效降低新生兒HBV感染率。乙肝疫苗能誘發(fā)持久的特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。二者結(jié)合能夠阻斷80%～90%的HBV母嬰傳播。IL-2、IFN-γ均為T(mén)h1型細(xì)胞產(chǎn)生。IL-2重要的作用是能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和分化。T細(xì)胞受多種刺激后可分泌IL-2，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、TNF 和 CSF 等)，同時(shí)，IL-2 還能作用于T細(xì)胞本身，誘導(dǎo)自身增殖、分化和發(fā)揮功能。IFN-γ是 NK細(xì)胞和 T細(xì)胞(包括 CD4+Th1和CD8+T細(xì)胞)都能產(chǎn)生，可作為抗原提呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的增殖、分化的調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)和抗病毒［6，7］。朱啟镕等認(rèn)為高表達(dá)量的 IFN-γ對(duì)病毒清除有重要作用。宮內(nèi)HBV感染兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞在HBsAg特異性刺激時(shí)IFN-γ分泌水平低于正常免疫兒童。說(shuō)明HBV宮內(nèi)感染與IFN-γ分泌水平不足有關(guān)。很多研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。綜上所述，IL-2與IFN-γ是一種誘導(dǎo)與被誘導(dǎo)的關(guān)系，同時(shí)IL-2還能誘導(dǎo)其自身增殖，有將免疫反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大的效應(yīng)，從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，IL-2的表達(dá)與IFN-γ的分泌關(guān)系密切，所以我們推測(cè)增強(qiáng)免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的水平，可以促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，從而打破細(xì)胞的免疫耐受，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

本研究提示IL-2分泌能力低下，誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的能力低下，可能是宮內(nèi)感染導(dǎo)致乙肝疫苗失敗的機(jī)制。因此外源性加入IL-2，加強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生足夠的IFN-γ，或可消除或逆轉(zhuǎn)免疫耐受，從而達(dá)到更有效的免疫應(yīng)答，但是本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需要大樣本的研究驗(yàn)證，且這種免疫治療的安全性和有效性還需要進(jìn)一步深入的研究。

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5 朱啟镕，于廣軍，呂 晴 et al．宮內(nèi)感染乙型肝炎病毒兒童接種乙型肝炎疫苗免疫失敗與其相關(guān)細(xì)胞因子關(guān)系研究［J］.中華兒科雜志，1999;37(7)：404-407.

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