轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1在顳葉癲癇模型小鼠海馬的表達(dá)變化

李 艷 趙旭東 (重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331)

癲癇的特點(diǎn)是腦部有持續(xù)存在的癲癇反復(fù)發(fā)作的易感性以及由于這種疾病引起的神經(jīng)生化、認(rèn)知、心理和社會(huì)后果。目前，癲癇發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明［1，2］，炎性反應(yīng)可以激發(fā)大量炎癥因子釋放，擾亂神經(jīng)通路，影響神經(jīng)傳導(dǎo)，對(duì)于癲癇發(fā)作的持續(xù)存在是必需的。然而，癲癇患者炎癥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)，越來(lái)越多研究表明，轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1(Transcription factor activator protein-1，AP-1)激活是細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［3，4］，其表達(dá)異?？梢饑?yán)重炎癥反應(yīng)，擾亂神經(jīng)通路，影響神經(jīng)傳導(dǎo)，損傷組織，進(jìn)一步引發(fā)各種神經(jīng)病理癥狀。故推測(cè)，AP-1可能通過(guò)炎癥反應(yīng)在癲癇發(fā)病中發(fā)揮一定作用。鑒于KA所誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型在病理學(xué)和行為學(xué)上的相似性，并且伴隨著海馬錐體神經(jīng)元的損傷等特點(diǎn)，因此成為研究人類癲癇的理想動(dòng)物模型［5］。本實(shí)驗(yàn)觀察了海人酸(Kainic acid，KA)側(cè)腦室注射誘導(dǎo)的癲癇(Epilepsy，EP)小鼠海馬AP-1表達(dá)，以探索AP-1異常表達(dá)在癲癇發(fā)病機(jī)制中所起作用。

1 材料與方法

1.1材料 C57小鼠(32只)，飼養(yǎng)條件：溫暖(20℃)，避強(qiáng)光、避噪音，單籠自由進(jìn)食和飲水。按照完全隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成模型組(24只)和對(duì)照組(8只)，模型組再按照不同處死時(shí)間分為造模后3、8、24小時(shí)，每組8只。海人酸(Kain-ic acid，KA;Sigma公司)，兔抗小鼠AP-1抗體(Santa Cruz公司)，生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司，武漢)，腦立體定向注射儀(深圳瑞沃德公司)。

1.2方法

1.2.1建立小鼠癲癇模型 模型組小鼠側(cè)腦室注射KA，分別于術(shù)后3、8、24小時(shí)觀察。以3.6%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射將小鼠麻醉后，將其頭部固定在立體定向儀上，常規(guī)備皮、消毒，沿頭部正中線切開(kāi)頭皮、暴露前囟。根據(jù)小鼠腦立體定向圖譜定位側(cè)腦室(前囟后0.4 mm，右側(cè)旁開(kāi)1.3 mm)，鉆直徑為1.0 mm的一個(gè)圓孔，深度達(dá)硬腦膜表面，注意盡量不傷及腦組織。將預(yù)先裝有KA的微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針，深度達(dá)1.7 mm時(shí)向側(cè)腦室內(nèi)緩慢注射1 μg/μl KA溶液1 μl(10分鐘內(nèi)勻速注射完畢)，留針5分鐘后拔除穿刺針，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進(jìn)行行為學(xué)觀察。按照Racine分級(jí)［5］判斷癲癇發(fā)作程度，Ⅲ級(jí)以上為成功動(dòng)物模型。如果造模失敗，則用相同數(shù)量動(dòng)物補(bǔ)充造模。對(duì)照組用等體積生理鹽水代替KA行側(cè)腦室注射。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)AP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 分別于術(shù)后3、8、24小時(shí)對(duì)麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。用Trizol法(Trizol試劑盒，天根公司)按說(shuō)明書提取總RNA?？俁NA純度和濃度使用紫外分光光度計(jì)(NanoPhotometer，Germany)測(cè)定，經(jīng)測(cè)定所用樣品的A260/A280比值都在1.8～2.0之間。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程也按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。應(yīng)用Prime premier 5.0軟件設(shè)計(jì)AP-1和內(nèi)參GAPDH基因引物。引物由上海英駿生物公司合成。引物序列如下：AP-1上游引物為 5＇CCCACCCAGTTCTTGTGCC3＇;AP-1 下游引物為5＇TGTTCTGGCTATGCAGTTCAGC3＇;擴(kuò)增片段為97 bp，GAPDH上游引物為5＇GCATTGTGGAAGGGCTCA3＇;GAPDH上游引物為5＇AAGGTGGAAGAGTGGGAGT3＇;擴(kuò)增片段為 379 bp。

PCR循環(huán)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 變性30秒，60℃退火30秒，72℃ 延伸2分鐘，35個(gè)循環(huán)后于72℃ 延伸10分鐘。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小分別為97 bp(AP-1)和379 bp(GAPDH)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，gold view染色。使用紫外光凝膠照像，經(jīng)Image軟件進(jìn)行灰度測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將AP-1的灰度值與GAPDH灰度值的比值進(jìn)行分析。

1.2.3Western blot檢測(cè)AP-1蛋白表達(dá)情況 分別于術(shù)后3、8、24小時(shí)對(duì)麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。將沖洗干凈的海馬組織置于含有2 ml蛋白提取緩沖液、蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)的2 ml的勻漿器中，研磨，收集研出液。冰水混合物孵育10分鐘后，4℃、12 000 r/min離心10分鐘，取上清分裝，-80℃保存。將蛋白樣本與5×SDS上樣液混合后，100℃煮沸5分鐘，加入上樣孔，130 V恒壓電泳約2小時(shí)，PVDF膜轉(zhuǎn)膜100 mA，30分鐘、5%脫脂奶粉封閉37℃，1小時(shí)，加入兔抗小鼠AP-1抗體(1∶1 000)，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)，37℃、1小時(shí)。TBST充分洗滌后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo)進(jìn)行曝光。使用Bio-rad發(fā)光成像儀分析與采集發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.4免疫組化檢測(cè)AP-1在海馬表達(dá)水平 分別于術(shù)后3、8、24小時(shí)對(duì)麻醉后小鼠斷頭取腦。用4%多聚甲醛緩沖液固定后，進(jìn)行石蠟包埋，在視交叉前端大腦和背側(cè)海馬處連續(xù)切片，切片厚4 μm。先用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)，在高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色一抗是兔抗小鼠AP-1抗體單克隆抗體(Santa cruz)，使用生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司)，室溫孵育10分鐘;滴加辣根酶室溫孵育20分鐘;DAB顯色，室溫5分鐘，顯微鏡觀察顯色效果。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用選擇相同區(qū)域、相同條件下用image進(jìn)行光密度分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)類型作方差分析和相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠行為學(xué)觀察結(jié)果 模型組小鼠在KA側(cè)腦室注射3小時(shí)后出現(xiàn)明顯反復(fù)發(fā)作的咀嚼、面部抽搐、肢體陣攣、身體背曲、尾部翹起、陣發(fā)性旋轉(zhuǎn)、站立跌倒、后退等癲癇發(fā)作癥狀。每次發(fā)作數(shù)秒至10余秒，反復(fù)間歇性發(fā)作數(shù)小時(shí)，8小時(shí)后逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)，24小時(shí)仍有發(fā)作，以Ⅱ～Ⅲ級(jí)發(fā)作為主。對(duì)照組小鼠無(wú)上述癇樣發(fā)作。

2.2癲癇發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間RT-PCR檢測(cè)AP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 應(yīng)用PCR進(jìn)一步證實(shí)AP-1在術(shù)后3、8、24小時(shí)，癲癇小鼠海馬組織中的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。圖1顯示，AP-1條帶位于97 bp左右，與預(yù)期產(chǎn)物大小保持一致。術(shù)后3、8、24小時(shí)，癲癇小鼠海馬AP-1表達(dá)皆上升(P＜0.05)，其中術(shù)后8h時(shí)表達(dá)最高(P＜0.01)，術(shù)后24小時(shí)時(shí)趨于降低，但是仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05，見(jiàn)圖1)。

2.3癲癇發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Western blot檢測(cè)AP-1蛋白表達(dá)情況 應(yīng)用Western blot進(jìn)一步證實(shí)AP-1在術(shù)后3、8、24小時(shí)，癲癇小鼠海馬組織中的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。圖2顯示，AP-1條帶位于43 kD左右，與預(yù)期產(chǎn)物大小保持一致。術(shù)后3、8、24小時(shí)，癲癇小鼠海馬AP-1表達(dá)皆上升(P＜0.05)，其中術(shù)后8小時(shí)時(shí)表達(dá)最高(P＜0.01)，術(shù)后24小時(shí)時(shí)趨于降低，但是仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05，見(jiàn)圖2)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)基因AP-1在各組小鼠海馬的表達(dá)Fig．1 mRNA expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

2.4癲癇發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化檢測(cè)AP-1在海馬表達(dá)水平 應(yīng)用免疫組織染色化學(xué)方法對(duì)癲癇發(fā)作小鼠及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)AP-1在海馬表達(dá)組織可中變化進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NS組海馬極少見(jiàn)到棕黃色顆粒沉積，提示正常海馬細(xì)胞內(nèi)AP-1表達(dá)很少。而模型組海馬可見(jiàn)有大量棕黃色顆粒沉積，提示癲癇小鼠海馬AP-1表達(dá)上升。而這些表達(dá)主要集中于海馬CA1區(qū)。特別是術(shù)后8小時(shí)，海馬可見(jiàn)有大片棕黃色顆粒沉積，提示術(shù)后8小時(shí)，癲癇小鼠海馬AP-1表達(dá)最高。各組間細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異。結(jié)果表明，術(shù)后3、8、24小時(shí)，癲癇小鼠海馬AP-1蛋白表達(dá)上升，術(shù)后8小時(shí)時(shí)表達(dá)最高，24小時(shí)有所下降(見(jiàn)圖3)。

3 討論

圖2 Western blot檢測(cè)蛋白AP-1在各組小鼠海馬的表達(dá)Fig．2 Protein expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

圖3 AP-1在各組小鼠海馬的免疫組化表達(dá)Fig．3 Immunohistochemistry staining of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

中國(guó)約有 900萬(wàn)癲癇患者，其中約600萬(wàn)是“活動(dòng)性癲癇”患者，同時(shí)每年新增癲癇患者約40萬(wàn)，癲癇患者的死亡危險(xiǎn)性為一般人群的2～3倍［7］。盡管現(xiàn)在有很多藥物可以治療癲癇，但是目前的抗癲癇藥對(duì)1/3的患者沒(méi)有作用［8］，可見(jiàn)了解癲癇的發(fā)病機(jī)制是治療癲癇的根本目標(biāo)。雖然癲癇的病因和發(fā)病機(jī)制至今不明，但是近十年來(lái)，越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，腦內(nèi)的炎癥過(guò)程可以損傷神經(jīng)細(xì)胞，影響神經(jīng)傳導(dǎo)，可能是癲癇發(fā)作的一個(gè)常見(jiàn)而有決定性的病理機(jī)制［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6等都參與了癲癇炎癥過(guò)程［9］。Maroso 等［10］研究認(rèn)為 IL-1β 和高遷移率族蛋白B1分別與IL-1R1和Toll樣受體4結(jié)合，通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)的放大作用激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB途徑，激活的核因子κB進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。這個(gè)轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)的相關(guān)炎性因子基因表達(dá)增強(qiáng)，引起海馬神經(jīng)元的損傷［11］。炎性介質(zhì)可以增加血管的通透性，使血清蛋白進(jìn)入腦內(nèi)影響離子緩沖能力，增強(qiáng)周圍神經(jīng)興奮性和抑制膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸，從而引起神經(jīng)元的過(guò)度興奮。進(jìn)一步可引發(fā)癲癇等一系列神經(jīng)系統(tǒng)病理癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應(yīng)發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。

研究證實(shí)，炎癥介質(zhì)大多受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子尤其AP-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)，導(dǎo)致炎癥持續(xù)和發(fā)展，進(jìn)而影響疾病的嚴(yán)重程度和對(duì)治療的反應(yīng)［12］。AP-1是由c-fos和c-jun蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態(tài)下，AP-1的蛋白濃度和活性極低，分子結(jié)構(gòu)以c-jun同源二聚體為主。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，c-jun、c-fos表達(dá)水平增高，并轉(zhuǎn)變?yōu)橐詂-fos、c-jun異源二聚體為主的存在形式，DNA連接和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄能力也迅速提高，促進(jìn)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄合成。Bobrovnikova-Marjon等［3］用AP-1蛋白的突變形式封閉AP-1活性后，發(fā)現(xiàn)IL-8的表達(dá)明顯受到抑制。因此，AP-1表達(dá)異?？梢l(fā)異常炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步損傷神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應(yīng)是否與AP-1表達(dá)異常相關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

海人酸側(cè)腦室注射可引起小鼠癲癇癥狀，為動(dòng)物癲癇經(jīng)典模型。已有研究表明，海人酸(Kainic acid，KA)在PC12離體神經(jīng)細(xì)胞死亡的同時(shí)伴有AP-1表達(dá)上升［11］，而抑制其激活則可降低神經(jīng)細(xì)胞死亡［12］，這些給我們的提示，AP-1在神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)毒性激活情況下，可能參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)KA側(cè)腦室注射引發(fā)小鼠癲癇模型海馬AP-1在術(shù)后3、8、24小時(shí)后AP1的基因和蛋白表達(dá)趨勢(shì)的觀察后發(fā)現(xiàn)，AP-1在癲癇小鼠海馬表達(dá)在術(shù)后3小時(shí)即開(kāi)始明顯上升，8小時(shí)達(dá)到高峰，24小時(shí)又開(kāi)始趨于下降，但仍高于對(duì)照組。說(shuō)明AP-1高表達(dá)與癲癇發(fā)病間可能具有密切關(guān)系。并且分布表達(dá)變化主要以海馬CA1區(qū)為主，可能作為CA1區(qū)海馬神經(jīng)元興奮的重要炎性標(biāo)志之一。但本實(shí)驗(yàn)屬于觀察性實(shí)驗(yàn)，尚不能說(shuō)明AP-1在癲癇發(fā)病中作用，還需進(jìn)一步研究。

綜上，AP-1高表達(dá)與癲癇發(fā)病間可能具有密切關(guān)系，進(jìn)一步研究可能為癲癇發(fā)病機(jī)制研究提供一條新的途徑。

1 Glass C K，Saijo K，Winner B et al．Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration［J］.Cell，2010;140(6)：918-934.

2 Wilson E H，Weninger W，Hunter C A.Trafficking of immune cells in the central nervous system［J］.J Clin Invest，2010;120(5) ：1368-1379.

3 Auvin S，Mazarati A，Shin D et al．Inflammation enhances epileptogenesis in the developing rat brain［J］.Neurobiol Dis，2010;40(1)：303-310.

4 Nagashima Shun，F(xiàn)ukuda Toshifumi，Kubota Yuka et al．Crmp5-associated gtpase(crag)protein protects neuronal cells against cytotoxicity of expanded polyglutamine protein partially via c-fos-dependent activator protein-1 activation［J］.J Biol Chem，2011;286(39)：33879-33889.

5 Ben-Ari Y，Tremblay E，Riche D et al．Electrographic，clinical and pathological alterations following systemic administration of kainic acid，bicuculline or pentetrazole：metabolic mapping using the deoxyglucose method with special reference to the pathology of epilepsy［J］.Neuroscience，1981;6(7)：1361-1391.

6 Racine R J.Modification of seizure activity by electrical stimulationⅡ-Motor seizure［J］.Electroencophaogr Clin Neurophysiol，1972;32(3)：281-294.

7 劉國(guó)軍 ，黃瑞雅.炎癥與癲癇［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011;17(24)：3687-3689.

8 Perucca E，F(xiàn)rench J，Bialer M.Development of new antiepileptic drugs：challenges，incentives，and recent advances［J］.Lancet Neurol，2007;6(9)：793-804.

9 Vezzani A，Balosso S，Ravizza T.The role of cytokines in the pathophysiology of epilepsy［J］.Brain Behav Immun，2008;22(6)：797-803.

10 Maroso M，Balosso S，Ravizza T et al．Toll-like receptor 4 and highmobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures［J］.Nat Med，2010;16(4)：413-419.

11 Wang L，Jing W.Glutamate-induced c-Jun expression in neuronal PC12 cells：the effects of ketamine and propofol［J］.J Neurosurg Anesthesiol，2008;20(2)：124-130

12 Meade A J，Meloni B P.AP-1 inhibitory peptides are neuroprotective following acute glutamate excitotoxicity in primarycortical neuronal cultures［J］.Neurochem ，2010;112(1)：258-270.