托瑞米芬逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP耐藥性的研究①

劉利則 夏 莉 劉玉俠 段北野 (吉林省人民醫(yī)院，長(zhǎng)春130021)

化療是惡性腫瘤治療的主要手段，但是在化療過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗藥性，影響治療效果。針對(duì)這一問(wèn)題，眾多學(xué)者都在探討能否用藥物使這種耐藥性逆轉(zhuǎn)同時(shí)使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性，保證治療效果。目前研究證實(shí)，托瑞米芬(TOR)對(duì)多種耐藥腫瘤細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)和增敏作用［1，2］，本研究采用托瑞米芬聯(lián)合順鉑(cDDP)對(duì)耐藥細(xì)胞A549/cDDP進(jìn)行逆轉(zhuǎn)和增敏實(shí)驗(yàn)，為托瑞米芬治療非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP：由本課題組建立，經(jīng)大劑量cDDP沖擊12次以后，MTT法檢測(cè)耐藥指數(shù)達(dá)4.2。枸櫞酸托瑞米芬：上海拜力生物有限公司產(chǎn)品;順鉑(cDDP)：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基、MTT、DMSO：購(gòu)自Sigma。Annexin V/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自碧云天公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1托瑞米芬(TOR)母液的配制 稱取2.99 mg枸櫞酸托瑞米芬，溶于5ml DMSO中，加5ml無(wú)血清 IMDM，混勻，即500 μmol/L。除菌，分裝，常溫密閉避光保存。

1.2.2 MTT法測(cè)定cDDP及cDDP+TOR聯(lián)合用藥對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP藥物敏感性的影響復(fù)蘇并培養(yǎng)A549/cDDP細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化，生理鹽水洗滌，計(jì)數(shù)，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液配成濃度為5×104ml-1單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μl/well。置于 CO2培養(yǎng)箱中，37℃ 5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)過(guò)夜，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞已貼壁，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。將細(xì)胞分為3組：?jiǎn)为?dú)cDDP組終濃度分別是 200、100、50、20、10、5 μmol/L，cDDP+TOR(5 μmol/L)組及 cDDP+TOR(10 μmol/L)組。每個(gè)藥物濃度設(shè)4復(fù)孔。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(以等體積的無(wú)血清IMDM代之)、陽(yáng)性對(duì)照(含1%DMSO)、TOR(5 μmol/L)對(duì)照和 TOR(10 μmol/L)對(duì)照。加入受試藥物cDDP，終濃度分別是200，100、50、20、10、5 μmol/L，TOR 終濃度 5 μmol/L、10 μmol/L，置37℃，5%CO2，飽和濕度條件下靜止培養(yǎng)68小時(shí)后加入 MTT(5 mg/ml)，20 μl/well，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí)，小心吸棄培養(yǎng)上清。加入 DMSO，150 μl/well，震蕩10分鐘，使結(jié)晶物全部溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A)，波長(zhǎng)為492 nm。

1.3計(jì)算公式 藥物對(duì)細(xì)胞抑制率=［陽(yáng)性對(duì)照孔吸光度值(A)-加藥孔吸光度值(A)］/陽(yáng)性對(duì)照孔吸光度值(A)×100%。半數(shù)抑制濃度(IC50)根據(jù)曲線方程求得。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=cDDP IC50/(cDDP+TOR)IC50。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)cDDP及cDDP+TOR聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP凋亡 實(shí)驗(yàn)分組和藥物濃度同上，采用Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，Coulter XL-MCL流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s表示，驗(yàn)證兩樣本資料符合正態(tài)分布后采用t檢驗(yàn)比較兩組間差異。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察見(jiàn)圖1A、B、C。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)Fig．1 Cell morphology

表1 MTT比色試驗(yàn)結(jié)果(x ± s，n=6)Tab．1 MTT colorimetric assay results(x ± s，n=6)

2.2TOR的細(xì)胞毒性測(cè)定 在本實(shí)驗(yàn)中，我們加設(shè)了TOR(終濃度5 μmol/L)對(duì)照和 TOR(終濃度10 μmol/L)對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，當(dāng)cDDP濃度為零時(shí)，單獨(dú) TOR(終濃度5 μmol/L或終濃度 10 μmol/L)，1%DMSO對(duì)A549/cDDP細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯影響，各組間數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。說(shuō)明單獨(dú)應(yīng)用TOR對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，無(wú)論終濃度是5 μmol/L或是10 μmol/L，與陽(yáng)性對(duì)照均無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

圖2 TOR逆轉(zhuǎn)cDDP對(duì)A549/cDDP抑制曲線Fig．2 Inhibition curve of TOR reversal cDDP on A549/cDDP

2.3 cDDP+TOR聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP對(duì)cDDP的耐藥性 圖2為T(mén)OR逆轉(zhuǎn)cDDP對(duì)A549/cDDP抑制曲線，不同濃度的cDDP對(duì)A549/cDDP細(xì)胞的增殖都有抑制作用，且隨著劑量的增加而加深。當(dāng)cDDP與TOR聯(lián)合作用時(shí)無(wú)論TOR 終濃度5 μmol/L或10 μmol/L，均能明顯增加cDDP對(duì)A549/cDDP細(xì)胞的敏感性(P＜0.05，P＜0.001)。其 IC50值分別為 39.06 μmol/L和30.64 μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.05倍和2.65倍。cDDP+TOR終濃度5 μmol/L與cDDP+TOR終濃度10 μmol/L之間除了在cDDP濃度為200 μmol/L時(shí)兩者有差異(P＜0.05)外其它均無(wú)明顯差異。

圖3 三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的半對(duì)數(shù)直線回歸曲線Fig．3 Semi-logarithmic linear regression curve of three experimental groups

圖4 藥物對(duì)A549/cDDP耐藥細(xì)胞作用凋亡圖Fig．4 Apoptosis figure of A549/cDDP resistant cells

2.4TOR增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)cDDP的敏感性的作用 由圖2三組數(shù)據(jù)我們可以得出3個(gè)方程，并由此得出其IC50值。cDDP組：y=-15.644+15.185x，r=0.989，IC50=75.41 μmol/L;cDDP+TOR(終濃度5 μmol/L)組：y=4.047+12.694x，r=0.988，IC50=37.34 μmol/L;cDDP+TOR(終濃度 10 μmol/L)組：y=7.528+12.536x，r=0.986，IC50=29.60 μmol/L。見(jiàn)圖3A、B、C。

2.5 cDDP及cDDP+TOR聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP凋亡 見(jiàn)圖4A、B、C。從流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可以看出，對(duì)照組細(xì)胞A549/cDDP凋亡率只有1.9%，cDDP對(duì)A549/cDDP的凋亡率為17.0%，而TOR聯(lián)合cDDP對(duì)A549/cDDP的凋亡率達(dá)到52.3%。

3 討論

目前肺癌發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤第一位，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數(shù)的80%［3］。由于NSCLC具有天然耐藥性及復(fù)雜的組織學(xué)組成，化療過(guò)程中常引起肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療不敏感，影響治療效果。一些研究證實(shí)，在肺癌組織中有雌激素受體(Estrogen receptor，ER)的高表達(dá)［4］，并且 ER 的含量和陽(yáng)性表達(dá)率與肺癌的分化程度和組織學(xué)類型及預(yù)后相關(guān)，使激素受體與腫瘤的關(guān)系的研究受到重視［5］，這為肺癌的內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)，也為肺癌的治療提供了新方法。

托瑞米芬(Toremifene，TOR)是雌激素受體(Estrogen receptor，ER)拮抗劑，它是由芬蘭Faraos研究組于1979年研制的新一代抗雌激素抗腫瘤藥物，TOR作為新一代的ER拮抗劑，與傳統(tǒng)的ER拮抗劑三苯氧胺相比，具有抗腫瘤特性強(qiáng)、毒副作用小、不致畸、不致癌等，與化療藥物聯(lián)合具有化療增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

對(duì)TOR化療增敏及逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥機(jī)制研究較多，可能的作用機(jī)制有以下幾方面［6-8］：TOR通過(guò)抑制蛋白激酶C活性，使P糖蛋白磷酸化水平降低，降低其活性，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高，增加化療藥物的細(xì)胞毒性，逆轉(zhuǎn)肺癌多藥耐藥;肺癌組織雌激素受體表達(dá)很高，而TOR是雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，通過(guò)與雌激素受體結(jié)合而對(duì)激素依賴性肺癌組織產(chǎn)生明顯抑制;TOR對(duì)Ca2+的雙向調(diào)節(jié)作用。另外還有研究表明，高濃度的TOR可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)選用的A549/cDDP耐藥細(xì)胞，是由本課題組用大劑量cDDP反復(fù)多次沖擊肺腺癌細(xì)胞A549后，建立的穩(wěn)定表達(dá)耐藥基因的耐藥細(xì)胞，經(jīng)MTT法檢測(cè)耐藥指數(shù)達(dá)4.2。以此為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選用托瑞米芬作為肺腺癌耐藥細(xì)胞A549的逆轉(zhuǎn)劑和化療藥物cDDP的增敏劑，通過(guò)不同劑量TOR與cDDP聯(lián)合對(duì)A549/cDDP進(jìn)行體外增敏及逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，證明當(dāng)cDDP與TOR聯(lián)合作用時(shí)無(wú)論TOR終濃度5 μmol/L 或 10 μmol/L，均能明顯增加 cDDP 對(duì)A549/cDDP細(xì)胞的敏感性(P＜0.05，P＜0.001)。其 IC50 值分別為 39.06 μmol/L 和 30.64 μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.05倍和2.65倍。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)可以看出，TOR與cDDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞死亡率明顯高于單獨(dú)應(yīng)用cDDP組(見(jiàn)圖1B、C)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)TOR對(duì)A549/cDDP細(xì)胞的凋亡作用，證明當(dāng) TOR與 cDDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，能明顯增加A549/cDDP細(xì)胞的凋亡率(52.3%)，單獨(dú)應(yīng)用cDDP組只有17%(見(jiàn)圖4)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，cDDP+TOR終濃度5 μmol/L與cDDP+TOR終濃度 10 μmol/L之間除了在 cDDP濃度為 200 μmol/L時(shí)兩者有差異(P＜0.05)外，其他均無(wú)明顯差異。說(shuō)明在cDDP低濃度時(shí)，5 μmol/L的TOR即能起到化療增敏及逆轉(zhuǎn)作用，避免了大劑量使用可能帶來(lái)的毒副作用，對(duì)臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1 王紅霞，張鳳春，樓麗廣 et al．托瑞米芬和他莫昔芬對(duì)MCF7、ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007;15(9)：1216-1221.

2 趙秋霞，陳寶安，程 堅(jiān) et al．漢防己甲素、托瑞米芬及其聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)K562細(xì)胞多藥耐藥的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008;16(1)：61-64.

3 Noble J，Ellis P M，Mackay J A et al．Second-line or subsequent system in therapy for recurrent or progressive non-small cell lung cancer：A systematic review and practice guile line［J］.J Thorac Oncol，2006;1(9)：1042-1058.

4 彭愛(ài)梅，蒼龍卿，劉蕊鳳 et al．肺癌組織雌/孕激素受體表達(dá)及三苯氧胺治療［J］.上海鐵道大學(xué)學(xué)報(bào)，2000;21(1)：59-62.

5 Watanabe T，Inoue S，Ogawa S et al．A gonistic effect of tamoxifen is dependent on cell type，ER E-promoter context，and estrogen receptor subtype：functional difference between estrogen receptors alpha and beta［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997;236(1)：140-144.

6 Miyati Y，Okada K，IshiBashi S et al．P-gp-induced modulation of regulatory volume increase occurs via PKC in mouse proxinal tubule［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002;282(1)：F65-F76.

7 Kavai H，Ishii A，Washiya K.Estrogen receptor alpha and beta are prognostic factors in non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res 2005;11(14)：5084-5089.

8 丁 娟，曹倍國(guó)，彭紅華.非小細(xì)胞肺癌雌激素受體表達(dá)和托瑞米芬治療現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006;13(5)：1389-1391.