加味歸脾湯對乳腺癌MDA-MB-435株抑制作用的研究＊

李晶哲，夏 蕓，馬琰巖，劉 紅，呂俊海，劉柏東

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2.賽諾菲安萬特(中國)公司，北京 100022)

乳腺癌是威脅婦女健康的主要惡性腫瘤，居女性易發(fā)惡性腫瘤之首。目前有許多方法如新藥泰索帝、赫賽汀等和放射療法促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，幫助人類提高乳腺癌患者的生存率，但是放射和化學(xué)療法帶來的巨大副作用使許多患者難以承受，并喪失了治療的機會。尤其對于雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性的乳腺癌患者，因為其高浸潤性的特性且靶向ER藥物無效，往往預(yù)后更差。中醫(yī)認(rèn)為，乳腺癌的主要病因和發(fā)病機制在于肝氣郁結(jié)、沖任失調(diào)、毒熱蘊結(jié)、氣血兩虛。中醫(yī)治療乳腺癌的原則主要為疏肝解郁、調(diào)補沖任、清熱解毒、益氣養(yǎng)血、健脾和胃等[1]。本文選用中藥方劑為具有補氣升陽、益衛(wèi)固表等功效的加味歸脾湯(《景岳全書》記載)，細(xì)胞為ER受體陰性的代表株MDA-MB-435株。以此對乳腺癌ER受體陰性的中醫(yī)治療做一研究，以明確該方劑對ER受體陰性乳腺癌產(chǎn)生的生物學(xué)作用。為便于今后發(fā)揮中藥聯(lián)合用藥的優(yōu)勢，進(jìn)一步研制出針對ER受體陰性乳腺癌有顯著作用的新藥。本文使用目前治療乳腺癌的一線藥物多西紫杉醇(Docetaxel)為陽性對照藥，該藥物主要作用于微管蛋白/微管系統(tǒng)，能促進(jìn)微管聚合，使細(xì)胞分裂阻滯于G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435(ATCC)。

1.2 藥品與試劑

加味歸脾湯原料藥(同仁堂);Docetaxel(Sanofi-Aventis);MTS(CellTiter 96RAQueous，Promega);細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測試劑盒(BD);Caspase-8檢測試劑盒(Promega);DMEM(GIBCO);胎牛血清(Hyclone)、細(xì)胞消化液(GIBCO)。

1.3 儀器設(shè)備

倒置顯微鏡(NIKON)、超凈臺(Heal Force)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標(biāo)儀(Bio-RAD)、流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435使用DMEM(含10%胎牛血清)，于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 藥物分組

2.2.1 Docetaxel濃度 5μg/ml

2.2.2 加味歸脾湯取人用方劑1劑(人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、棗仁各 1 2 g，遠(yuǎn)志、當(dāng)歸、柴胡、山梔各6 g，木香、炙甘草各3 g)，煎煮2次，合并藥液濃縮至標(biāo)準(zhǔn)藥液量200 ml，滅菌后用細(xì)胞培養(yǎng)液按體積比配制為高濃度(10%)、中濃度(5%)、低濃度(2.5%)。

2.2.3 藥物分組 Docetaxel組;加味歸脾湯高濃度、中濃度、低濃度組;陰性對照組(不給藥)。

2.3 抑制率檢測

每24 h檢測1次，連續(xù)檢測72 h。MTS法依據(jù)試劑盒說明書操作。培養(yǎng)采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Coring，3599)，檢測前小心移除培養(yǎng)液，加入CellTiter 96R Aqueous，37℃5%CO2條件下孵育1 h后酶標(biāo)儀檢測。計算公式為(1－OD給藥÷OD陰性對照)×100%。

2.4 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測

檢測第72小時的狀態(tài)。采用AnnexinⅤ-FITC/PI標(biāo)記，依據(jù)試劑盒說明書操作。收集細(xì)胞以PBS洗滌3遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105個/ml，標(biāo)記染料后于黑暗處靜置15 min，流式細(xì)胞儀分析。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

2.5 Caspase-8檢測

每24 h檢測1次，連續(xù)檢測72 h。依據(jù)試劑盒說明書操作，在405 nm處測定吸光度值，細(xì)胞濃度為3×106個/ml。

2.6 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS11.5進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗，P＜0.05為有顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 藥物對細(xì)胞的抑制率

表1顯示，中藥各濃度組與其同時間的Docetaxel組比較。

表1 藥物對細(xì)胞的抑制率

表1 藥物對細(xì)胞的抑制率

注:與其同時間的Docetaxel組比較:*P＜0.05

藥物組時間 Docetaxel 中藥高濃度中藥中濃度中藥低濃度陰性對照組24 h 30.5±3.76 23.2±2.29* 10.3±2.61* 3.2±1.15*0 48 h 57.2±5.22 62.7±3.98* 30.3±4.21* 13.6±3.42* 0 72 h 75.6±5.18 75.2±6.12 41.5±5.37* 24.6±3.39*0

3.2 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡

圖1顯示，中藥組誘導(dǎo)多為晚期凋亡，中藥高濃度組晚期凋亡數(shù)量較多為85.9%。隨中藥劑量的降低，中藥中濃度和低濃度組正常細(xì)胞數(shù)逐漸增多，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少。中藥中濃度組為38.7%，中藥低濃度組為25.3%，流式細(xì)胞檢測結(jié)果與MTS檢測結(jié)果基本相符。

3.3 Caspase-8檢測

表2顯示，中藥各濃度組與其同時間的Docetaxel組比較。

表2 Caspase-8表達(dá)量統(tǒng)計

表2 Caspase-8表達(dá)量統(tǒng)計

注:與其同時間的Docetaxel組比較:*P＜0.05

藥物組時間 Docetaxel 中藥高濃度 中藥中濃度 中藥低濃度 陰性對照組24 h 0.677±0.029 0.513±0.025* 0.383±0.011* 0.201±0.011*0.062±0.008 48 h 0.782±0.032 0.829±0.035* 0.492±0.023* 0.252±0.018* 0.071±0.011 72 h 0.463±0.028 0.561±0.023* 0.235±0.016* 0.171±0.007*0.079±0.010

圖1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

4 討論

本實驗結(jié)果表明，中藥方劑加味歸脾湯對乳腺癌細(xì)胞ER受體陰性代表株MDA-MB-435抑制作用明顯，且經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測多為誘導(dǎo)晚期凋亡。與對照藥物Docetaxel相比，高濃度中藥作用效果與用于乳腺癌一線治療的藥物相當(dāng)。

設(shè)法促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)分子的表達(dá)，使其恢復(fù)對凋亡誘導(dǎo)的敏感性是腫瘤治療的策略之一。半胱酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspanate specific protease，Caspase)是一類與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶。根據(jù)在細(xì)胞凋亡機制中的作用，Caspase家族主要有細(xì)胞凋亡啟動作用和細(xì)胞凋亡執(zhí)行作用兩類功能[2、3]。凋亡啟動作用的Caspase分子在外來蛋白信號的作用下被切割激活后，對凋亡執(zhí)行作用的Caspase進(jìn)行切割并使之激活，使Caspase靶蛋白水解，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。Caspase-8通過寡聚而自身切割活化，并激活下游半胱氨酸蛋白酶，產(chǎn)生不可逆凋亡作用[4、5]。Caspase-8主要起著發(fā)起者作用，它是死亡受體通路的關(guān)鍵蛋白酶，當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡因素的刺激時，可使死亡配體(TNFα、Fas、TRAIL)和相應(yīng)的死亡受體相結(jié)合，引起上游的Caspase-8活化，活化的Caspase-8能激活如Caspase-3等下游Caspase。被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可將凋亡信號從非依賴線粒體途徑傳遞到線粒體途徑，把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來，放大凋亡信號[6、7]。加味歸脾湯可以誘導(dǎo)Caspase-8高表達(dá)，可以初步確定其抗腫瘤原理與死亡受體途徑相關(guān)。

我國臨床各類中、晚期癌癥患者多用扶正固本方劑，這種方劑對提高患者近期、遠(yuǎn)期療效都有益處。各種治療乳腺癌的方劑中祛瘀扶正的藥物為必用之物[8]。中藥辨證施治用藥的精華是調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境，它的作用是多靶點、多部位、多途徑、多效應(yīng)的，作用機制異常復(fù)雜。本文從其中1個方面對1劑治療乳腺癌的方劑進(jìn)行研究，在實驗過程中初步檢測到該方劑與現(xiàn)在正在使用的西藥一線藥物作用相當(dāng)，而中藥的毒副作用和價格能使廣大患者更容易接受。對于該中藥復(fù)方的研究還將繼續(xù)從其他方面進(jìn)行，最終確定整體藥效學(xué)，為腫瘤臨床開發(fā)出生物活性高且低毒的新型藥物提供參考。

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