生地黃免煎顆粒對(duì)大鼠腦缺血后Nogo-A蛋白表達(dá)的干預(yù)*

宋紅普魏江磊吳中華韓振祥吳中平朱暉李歡歡

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203；3.上海市曹楊街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海200310）

成人腦缺血造成的中樞神經(jīng)損傷后不能再生，是導(dǎo)致腦缺血遺留有各種后遺癥難以完全康復(fù)的重要原因。中樞神經(jīng)損傷后不能再生，除了與膠質(zhì)疤痕的空間阻礙作用和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏有關(guān)外，主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著抑制神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制因子［1］。本研究在前期發(fā)現(xiàn)生地黃及其主要組分梓醇對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察生地黃免煎顆粒對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，探討其對(duì)缺血性腦損傷后的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性健康SD大鼠120只分批購(gòu)入，每批20只，清潔級(jí)，體質(zhì)量230～250 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自上海西普-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016，大鼠購(gòu)入后入IVC系統(tǒng)分籠飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右，體質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求之后準(zhǔn)備手術(shù)造模。1.2造模方法 參照文獻(xiàn)采用改良的Longa法［2］制備大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型，術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水。用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥位固定于鼠板上，頸部備皮，局部消毒之后行頸前部正中切口。分離右側(cè)頸部肌肉，依次暴露右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總和頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈掛線，用止血鉗夾住兩端線頭交叉放置于手術(shù)臺(tái)上，拉緊頸內(nèi)動(dòng)脈掛線之后，用手術(shù)纖維剪于頸總動(dòng)脈分叉下方1cm處剪一切口，將預(yù)先購(gòu)得的頭端包被多聚賴(lài)氨酸的尼龍栓線向分叉端插入頸總動(dòng)脈。松開(kāi)拉住頸內(nèi)動(dòng)脈栓線的止血鉗后，用手拉緊結(jié)扎頸總動(dòng)脈的線頭，用眼科鑷將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈17～18 mm，直到有輕微阻力感為止。連同插入的尼龍栓線一起扎緊頸內(nèi)動(dòng)脈掛線，剪去露在血管外的尼龍栓線，縫合創(chuàng)口及皮膚。再次消毒后每只大鼠腹腔分別注射4 mL生理鹽水，將大鼠置于放有清潔墊料的鼠籠中進(jìn)行觀察。假手術(shù)組大鼠麻醉，暴露頸內(nèi)、外動(dòng)脈分支后，僅結(jié)扎右側(cè)頸總、頸外與頸內(nèi)動(dòng)脈，不插入尼龍栓線。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)分及納入標(biāo)準(zhǔn)造模大鼠清醒后2 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。神經(jīng)功能評(píng)分按照Longa的標(biāo)準(zhǔn)［2］，進(jìn)行5級(jí)評(píng)分：0分為無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值在1～3分者為造模成功，納入相應(yīng)組別，0分和4分者剔除。凡術(shù)中出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、死亡、或者神經(jīng)評(píng)分不符合標(biāo)準(zhǔn)的均為模型制作失敗，不納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另隨機(jī)補(bǔ)充大鼠造模，保證每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量不變。

1.4 分組將造模成功并經(jīng)神經(jīng)功能評(píng)分篩選后的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為用藥組和模型組，另設(shè)假手術(shù)組。3組大鼠入組后又各自按照取材時(shí)間窗的不同分為3、7、14 d各3個(gè)亞組，記錄每組大鼠的編號(hào)，并加以跟蹤。各組大鼠在造模成功經(jīng)分組后，放回IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)。

1.5 藥物干預(yù)將生地免煎顆粒（購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，由三九醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：10090425）溶于適量清潔自來(lái)水中，配制成生地黃含量為135 g/L的生地黃免煎顆粒溶液。用藥組大鼠分組稱(chēng)體質(zhì)量后按照1 mL/100 g灌胃，上下午各1次。模型組和假手術(shù)組均同時(shí)給予相同體積的清潔自來(lái)水灌胃。各組大鼠均每3日稱(chēng)體質(zhì)量1次，并依據(jù)各自體質(zhì)量調(diào)整大鼠的灌胃量，灌胃持續(xù)至大鼠處死取材之前。

1.6 標(biāo)本采集各亞組大鼠分別在各自相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，取材時(shí)先將大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛深麻醉。將大鼠俯臥位放置于冰上，用剪刀從背部剪開(kāi)項(xiàng)部皮膚及肌肉，剪短頸椎及脊髓，即可見(jiàn)到有血液從頸部斷開(kāi)處流出，待頸部血液流盡后，用剪刀沿頂骨與枕骨交界處縱向剪開(kāi)一小口，將剪刀尖部從剪開(kāi)的縫隙中插入，注意不要觸及腦組織。向上外側(cè)用力分別撐開(kāi)兩塊頂骨，暴露出兩側(cè)大腦半球，用鑷子小心撕開(kāi)軟腦膜；用眼科剪沿腦干向下剪短脊髓，換眼科鑷捏住連在腦干上的脊髓段，將腦干及相連的脊髓拉出；將眼科剪輕插入大腦底部的空隙中，輕輕向上翹起大腦，剪斷顱底的三叉神經(jīng)和視神經(jīng)，將整個(gè)腦干與顱底結(jié)構(gòu)分離，最后剝離嗅腦并取出完整大腦。在放于碎冰上的培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀片將距額極5 mm處切取2 mm厚的冠狀切片，取切片右側(cè)含皮質(zhì)及缺血半暗帶腦組織約50 mg左右，放入預(yù)先標(biāo)記好的凍存管，轉(zhuǎn)移至-80℃的冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測(cè)方法 （1）通過(guò)對(duì)造模前大鼠體質(zhì)量及造模結(jié)束后2 h神經(jīng)功能評(píng)分的觀察，了解用藥前各組大鼠的基線是否一致。（2）采用Western Blot法檢測(cè)腦組織中Nogo-A的表達(dá)量，一抗購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二抗購(gòu)自Jackson公司，內(nèi)參抗體購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰?。Western Blot檢測(cè)方法 參照有關(guān)文獻(xiàn)和試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，依照組織總蛋白提取、蛋白含量測(cè)定、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉與抗體孵育步驟進(jìn)行，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)，并將膠片或顯色后的濾膜進(jìn)行掃描或拍照，各組樣本經(jīng)過(guò)Western Blot檢測(cè)之后輸出顯色條帶。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，通過(guò)計(jì)算各樣品與GAPDH內(nèi)參蛋白的比值，得出Nogo-A蛋白的相對(duì)表達(dá)量，在此基礎(chǔ)上分析生地黃對(duì)MCAO造模后大鼠Nogo-A蛋白表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用IBM SPSS Statistics19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：基線一致性檢驗(yàn)造模前進(jìn)行，分別通過(guò)方差分析和Kruskal-WallisH檢驗(yàn)分析不同組別大鼠體質(zhì)量和神經(jīng)學(xué)評(píng)分；通過(guò)方差分析檢驗(yàn)造模后相同時(shí)間點(diǎn)不同組別之間Nogo-A蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線一致性檢驗(yàn)見(jiàn)表1，表2。造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。用藥組與模型組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 造模前各組大鼠體質(zhì)量比較（g，s）

表1 造模前各組大鼠體質(zhì)量比較（g，s）

組別n3 d 7 d14 d用藥組6238.34±7.234模型組6235.50±17.108 237.00±14.353229.14±16.416 237.00±10.770226.50±5.875假手術(shù)組6231.50±20.345232.33±17.212231.67±14.706

表2 各組大鼠造模清醒后神經(jīng)學(xué)評(píng)分比較（n）

2.2 Nogo-A蛋白表達(dá)情況見(jiàn)表3。在造模后第3日和7 d時(shí)間點(diǎn)上，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在第14日時(shí)間點(diǎn)上，與模型組比較，用藥組出現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠Nogo-A蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠Nogo-A蛋白表達(dá)比較（±s）

與模型組同時(shí)段比較，*P＜0.05。

組別n3 d 7 d14 d用藥組60.727±0.422模型組61.968±2.087 1.281±0.3081.061±0.467*3.293±2.4062.010±0.581假手術(shù)組61.020±0.2601.195±0.8131.625±0.698

2.3 不同時(shí)間窗各組Nogo-A蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)變化見(jiàn)圖1。用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達(dá)在造模后3～14 d均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且模型組的波動(dòng)更加明顯一些。造模后第3日用藥組Nogo-A的表達(dá)水平較模型組為低。到造模后第7日時(shí)，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達(dá)均有所升高，模型組升高的幅度更大一些。到了第14日，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達(dá)均有下降，且用藥組明顯低于模型組，出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。造模后3～14 d，用藥組和假手術(shù)組Nogo-A蛋白的表達(dá)始終低于模型組，用藥組和假手術(shù)組相比水平相近或略低。

圖1 各組不同時(shí)間Nogo-A蛋白表達(dá)情況（±s）

3 討論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，該病起病急驟，發(fā)病迅速，而且難以徹底治愈，往往會(huì)留有各種不同程度的后遺癥。成人腦缺血后造成的中樞神經(jīng)損傷后不能再生，是造成腦缺血后遺留有各種后遺癥，難以完全康復(fù)的重要原因。研究表明，中樞神經(jīng)元不能再生，除了與膠質(zhì)疤痕的空間阻礙作用和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的缺乏之外，主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著抑制神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制因子，這些抑制因子主要包括硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）、NG2蛋白多糖、可溶性髓磷脂相關(guān)糖蛋白（MAG）、少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）和Nogo蛋白。其中，Nogo蛋白作為抑制中樞神經(jīng)再生最重要的物質(zhì)，越來(lái)越受到人們的重視。Nogo是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中發(fā)現(xiàn)的一種抑制軸突生長(zhǎng)的蛋白，因它對(duì)軸突生長(zhǎng)具有抑制作用而被命名為Nogo，編碼Nogo蛋白的基因稱(chēng)為Nogo基因。由于啟動(dòng)子和剪切方式的不同，Nogo基因可以表達(dá)出3種mRNA的轉(zhuǎn)錄體，它們所編碼的蛋白質(zhì)分別稱(chēng)為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C［3-4］。其中，Nogo-A是Nogo蛋白中最主要的形式，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由少突膠質(zhì)細(xì)胞和一些神經(jīng)元產(chǎn)生，存在于髓鞘的內(nèi)外環(huán)和少突膠質(zhì)細(xì)胞表面，是突觸再生抑制物［5］。Nogo是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘磷脂中最重要的一種抑制軸突生長(zhǎng)錐再生的蛋白質(zhì)，它可導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷并抑制神經(jīng)元突起的延伸，也能夠被特異性抗體IN-1識(shí)別。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)Nogo基因的表達(dá)變化特別敏感，針對(duì)Nogo-A的抗體可抵消中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘在體外的抑制活性，表明Nogo蛋白具有強(qiáng)烈的中樞神經(jīng)生長(zhǎng)抑制活性。

臨床實(shí)踐表明，中藥生地黃制劑對(duì)中風(fēng)急性期腦損傷治療有可靠療效［6-7］，機(jī)理研究也顯示中藥生地黃及其主要組分梓醇有促使神經(jīng)元超極化，保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞毒性損傷［8-10］，減輕腦缺血后神經(jīng)元凋亡［11-12］等作用，顯示中藥生地黃及其組分梓醇對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用。另外，梓醇還可上調(diào)腦缺血大鼠缺血周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（GAP-43）的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生，加速神經(jīng)功能恢復(fù)［13］。但在生地黃對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)的研究方面，尚不多見(jiàn)。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 來(lái)看，經(jīng)MCAO造模造成腦缺血損傷之后，Nogo-A蛋白的表達(dá)出現(xiàn)升高趨勢(shì)，且呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第7日表達(dá)最為活躍；MCAO造模后經(jīng)生地黃免煎顆粒溶液灌胃干預(yù)以后，Nogo-A蛋白的表達(dá)水平均較模型組降低，且呈現(xiàn)先升高后又緩慢恢復(fù)的趨勢(shì)；相對(duì)于模型組，在造模后第14日，生地黃對(duì)Nogo-A蛋白的表達(dá)有明顯的下調(diào)作用。

由此可見(jiàn)，生地黃免煎顆粒能夠在一定程度上下調(diào)MCAO造模后引起的Nogo-A蛋白表達(dá)升高，有利于中樞神經(jīng)缺血后的神經(jīng)再生。

［1］ 宋紅普.Nogo蛋白及其受體與中樞神經(jīng)再生［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20（3）：442-444.

［2］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery oc clusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84.

［3］ Chen MS，Huber AB.Schwab ME，et al.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and antigen for monoclonal antibody［J］.Nature，2000，403（6768）：434-439.

［4］ Walmsley AR，Mir AK.Targeting the Nogo-A signalling pathway to promote recovery following acute CNS injury［J］.Curr Pharm Des（S1381-6123），2002，137：361-369.

［5］ Chen Y，Tang X，Cao X，et al.Human Nogo-C overexpression induces HEK293 cell apoptosis via a mechanism that involves JNK-c-Jun pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348（3）：923-928.

［6］ 俞曉飛，王左，魏江磊.中風(fēng)辨治陰虛為本及養(yǎng)陰法治療出血性中風(fēng)臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2007，13（9）：683-684.

［7］ 俞曉飛，王左，魏江磊.生地注射液治療急性腦出血臨床研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，21（4）：30-31.

［8］ 韓振翔，魏江磊，祁麗麗，等.生地預(yù)處理在減輕全腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009（9）：810-813.

［9］ 韓振翔，魏江磊，祁麗麗，等.生地預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠血清TNF與NSE表達(dá)的影響［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，（3）：248-251.

［10］ 劉愛(ài)華，俞曉飛，汪洋，等.生地注射液對(duì)凝血酶損傷后神經(jīng)元保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（3）：155-158.

［11］ Li DQ，Bao YM，Li Y，et al.Catalpol modulates the expressions of Bcl-2 and Bax and attenuates apoptosis in gerbils after ischemic injury［J］.Brain Res，2006，1115（1）：179-185.

［12］ Li DQ，Bao YM，Li Y，et al.Catalpol prevents the loss of CAI hippocampal neurons and reduces working errors in gerbils after ischemia-reperfusion injury［J］.Toxicon，2005，46（8）：845-851.

［13］ ?；埏L(fēng)，萬(wàn)東，羅勇，等.梓醇上調(diào)GAP-43表達(dá)伴隨局灶腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（9）：1231-1236.