高效液相色譜在高血壓診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

梁瑞峰，王 軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所藥理實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450004)

高血壓一般分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓兩種，其中原發(fā)性高血壓約占95%以上［1］，據(jù)估計(jì)全球約有10億高血壓病患者，且患病率總體呈明顯上升趨勢(shì)。高血壓具有患病率高、致殘率高、死亡率高和知曉率低、服藥率低、控制率低的特點(diǎn)。因此對(duì)其進(jìn)行有效防治已成為世界范圍內(nèi)共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。高效液相色譜(HPLC)技術(shù)具有適用范圍廣、選擇性強(qiáng)、分析速度快、靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，在藥物和臨床樣品檢驗(yàn)分析中已被廣泛應(yīng)用。本文就高效液相色譜技術(shù)在高血壓診斷中的應(yīng)用文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 兒茶酚胺類物質(zhì)的HPLC檢測(cè)

兒茶酚胺是腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)及多巴胺(dopamine，DA)的總稱，主要由交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)產(chǎn)生和釋放。腎上腺髓質(zhì)主要產(chǎn)生腎上腺素和少量的去甲腎上腺素，交感神經(jīng)主要分泌去甲腎上腺素。兩者在單胺氧化酶(MAO)和兒茶酚胺O－甲基轉(zhuǎn)換酶(COMT)作用下通過2種不同代謝途徑最終生成3－甲氧－4－羥苦杏仁酸(VMA)，與葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合成酯類從尿中排出，在病理情況下，特別是嗜鉻組織的腫瘤，分泌產(chǎn)生大量腎上腺素和去甲腎上腺素，引起血壓升高。測(cè)定其血漿濃度可為高血壓病的鑒別診斷提供依據(jù)［2－4］。高效液相色譜法因其高分離效率而廣泛應(yīng)用于兒茶酚胺類物質(zhì)的分析檢測(cè)，其中，以HPLC與電化學(xué)分析法(ECD)相結(jié)合的方法最為常用。近年來，HPLC同質(zhì)譜(MS)和熒光檢測(cè)法(FL)的聯(lián)用也逐漸發(fā)展起來。

1.1 HPLC－ECD

國(guó)內(nèi)外有很多采用HPLC－ECD檢測(cè)兒茶酚胺類物質(zhì)的報(bào)道，分別檢測(cè)了組織樣品［5］、血漿樣品中的兒茶酚胺類物質(zhì)［6］。Sabbioni等［7］通過對(duì)HPLC－ECD中的庫侖法和安培法2種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)2者均有很好的線性、提取率和精密度，但庫侖檢測(cè)法在靈敏度、選擇性和抗干擾方面明顯優(yōu)于安培檢測(cè)法。為了在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離，對(duì)色譜參數(shù)(如色譜柱型號(hào)、流動(dòng)相、平衡時(shí)間)進(jìn)行了研究，最后選擇 C8柱，流動(dòng)相為 pH 3.5、甲醇含量為50 g/L的水溶液，平衡時(shí)間至少4 h。

1.2 HPLC－MS

HPLC－MS檢測(cè)兒茶酚胺類物質(zhì)可提供有用的結(jié)構(gòu)信息，比普通的紫外檢測(cè)有更好的選擇性。Kushnir等［8］采用HPLC結(jié)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI－MS/MS)分析尿中的兒茶酚胺類物質(zhì)，采用兩步液液萃取法處理樣品，用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)來定性E、NE和DA，選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)E為m/z184/107和184/77、NE為m/z170/107和170/77、DA為m/z 154/91和154/65。此法對(duì)含兒茶酚基團(tuán)的化合物有一定的特異性，能排除藥物及其代謝物的干擾。

1.3 HPLC－FL

HPLC－FL用于分析人血漿中的兒茶酚胺類物質(zhì)，其原理是因?yàn)閮翰璺影奉愇镔|(zhì)本身有自然熒光，所以樣品經(jīng)Al2O3處理后可直接進(jìn)行熒光檢測(cè)［9］。但由于自然熒光相對(duì)較弱，一般需采用衍生化來提高檢測(cè)靈敏度，采用的衍生化方法主要為柱后衍生化和柱前衍生化。

2 非對(duì)稱性二甲基精氨酸的HPLC檢測(cè)

一氧化氮(nitric oxide，NO)是機(jī)體內(nèi)重要的血管舒張因子，可以調(diào)節(jié)血管收縮張力，并通過抑制平滑肌細(xì)胞收縮和血小板的聚集影響血液循環(huán)，在舒張血管及調(diào)節(jié)血壓等方面起著十分重要的作用。NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthosis，NOS)以1－精氨酸及氧分子為底物催化合成的，在NO前體充分存在的情況下，NO的合成主要受細(xì)胞內(nèi)NOS的調(diào)節(jié)。因此，NOS的含量及活性的變化是影響NO合成的重要因素。近年來的研究表明，機(jī)體內(nèi)存在著一種調(diào)節(jié)NO合成的內(nèi)源性機(jī)制，即1－精氨酸的同類物非對(duì)稱性二甲基精氨酸(asymmetrica1 dimethy1arginine，ADMA)與NOS結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制NO的合成。ADMA是一分子量為202 D的小分子物質(zhì)，廣泛存于人的血漿、尿液及血管內(nèi)皮細(xì)胞中［10］。高血壓患者血清ADMA濃度明顯升高，尿ADMA濃度降低，血清ADMA濃度與收縮壓及舒張壓呈正相關(guān)。健康人血漿ADMA水平為(0.42±0.06)μmol/L，在無癥狀的高膽固醇血癥年輕患者，血漿ADMA水平升高到(2.2± 0.2)μmol/L。有學(xué)者采用HPLC層析法檢測(cè)ADMA:取血清樣本，沉淀劑沉淀，取上清液加鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生，用同溶劑反相HPLC分離，以熒光檢測(cè)器分析［11－12］，但OPA熒光產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響了控制分析結(jié)果的重現(xiàn)性和靈敏度。張和順等［13］用一種新的衍生試劑萘－2，3－二羧基醛，并改進(jìn)原有色譜條件，建立了一種操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測(cè)人血漿中ADMA濃度的方法。王洪巨等［14］用高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜(HPLC－MS)的方法測(cè)定人血漿中的ADMA濃度，方法更加靈敏。

3 同型半胱氨酸的HPLC檢測(cè)

同型半胱氨酸(Homocystine，Hcy)是蛋氨酸分解代謝過程中產(chǎn)生的一種含硫氨基酸。血漿Hcy包括還原型Hcy、雙硫Hcy、混合雙硫半胱氨酸－Hcy和混合雙硫蛋白質(zhì)－Hcy。正常情況下游離Hey很少，主要以蛋白質(zhì)形式存在。Hcy主要通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫2條途徑進(jìn)行代謝。近年來，許多流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，由Hcy代謝異常導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥是引起高血壓的主要危險(xiǎn)因素，因此在高血壓及心腦血管疾病患者中定期進(jìn)行血漿Hcy檢測(cè)，是心腦血管疾病診斷最獨(dú)特、最有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一［15］。正常情況下血漿同型半胱氨酸含量甚微，人體血中的Hcy水平在10μmol/L以上稱為高同型半胱氨酸血癥或血漿同型半胱氨酸水平升高［16］。1項(xiàng)6個(gè)城市研究中心的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)成年高血壓患者中伴有高Hcy者約占75%(男性占91%，女性占60%)，伴有高Hcy的原發(fā)性高血壓，定義為“H型”高血壓［17］。過去由于測(cè)定技術(shù)的難度，曾一度認(rèn)為血漿內(nèi)不含同型半胱氨酸。1985年Resum等最先建立了同位素測(cè)定Hcy方法，1987年Stabier報(bào)道了氣相色譜檢測(cè)法。目前應(yīng)用最廣泛的是高效液相色譜法，根據(jù)檢測(cè)方法的不同，可分為熒光法和電化學(xué)法。

3.1 HPLC－FL

血漿中同型半胱氨酸經(jīng)三丁基磷還原后與巰基特異結(jié)合的熒光物質(zhì)SBD－F進(jìn)行衍化反應(yīng)形成帶有共軛結(jié)構(gòu)的化合物，受紫外光激發(fā)后，能輻射出熒光，在一定條件下，熒光強(qiáng)度和樣品的濃度成正比。此外，因其形成的不同化合物結(jié)構(gòu)和極性的不同，在色譜中的保留時(shí)間存在差異，因此可利用HPLC－FL檢測(cè)出血漿中的Hcy的濃度。一般情況下，同型半胱氨酸濃度在0～45μmol/L范圍內(nèi)與絕對(duì)峰面積比呈線性關(guān)系，回收率為92.13%～108.04%。HPLC－FL測(cè)定血漿Hcy的方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 HPLC－ECD

HPLC－ECD具有樣本處理簡(jiǎn)單、無需衍生等特點(diǎn)，且有較高的靈敏性、專一性和穩(wěn)定性，應(yīng)用較為廣泛。但由于電化學(xué)檢測(cè)器工作電極表面易被氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物污染，易出現(xiàn)被檢測(cè)物響應(yīng)降低的現(xiàn)象。因此，檢測(cè)前可先用6 mmol/L的硝酸清洗流動(dòng)池、電化學(xué)檢測(cè)器采用脈沖方式?jīng)_洗工作電極或用重鉻酸鉀洗液浸泡1 min等方法，降低基線噪音和漂移，提高檢測(cè)靈敏度，使峰形更穩(wěn)定而無干擾［18］。

4 HPLC在高血壓中醫(yī)辨證分型中的應(yīng)用

高血壓的中醫(yī)辨證分型主要有肝陽上亢、肝腎陰虛、陰陽兩虛、氣虛痰濁等，其中肝陽上亢型較為多見［19］。李寶國(guó)等［20］通過比較健康人與肝陽上亢型高血壓患者血漿的HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血漿HPLC圖譜與正常血漿HPLC圖譜有明顯的差異，可以用血漿HPLC圖譜方法輔助高血壓的診斷。蔣海強(qiáng)等［21］應(yīng)用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用和主成分分析的方法研究高血壓肝陽上亢證，通過對(duì)高血壓肝陽上亢患者和健康志愿者尿液樣品的分析和模式識(shí)別，顯示該方法能夠區(qū)分高血壓肝陽上亢患者和健康志愿者的尿液樣品。盡管在高血壓肝陽上亢患者和健康上造成了兩組樣本的交叉，但從主成分分析得分圖可以看出，兩組樣本基本能夠分開，且類別清晰、明確。該方法有利于深入認(rèn)識(shí)和理解高血壓肝陽上亢證的本質(zhì)，同時(shí)為該類疾病的臨床診斷和治療研究提供依據(jù)。

5 小結(jié)

高血壓發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，并發(fā)癥多，患病率呈逐年上升趨勢(shì)，是心腦血管疾病的首要危險(xiǎn)因素［22］，嚴(yán)重危害了人們的身心健康。高效液相色譜(HPLC)技術(shù)分析速度快、靈敏度高，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)可以輔助診斷高血壓，進(jìn)行較早和較準(zhǔn)確的治療，使患者盡早脫離或者減輕高血壓的困擾。

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