骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化神經(jīng)樣細(xì)胞功能的研究進(jìn)展

任瑞芳 綜述 黃良國 審校

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 遵義 563000

1 體外誘導(dǎo)MSCs分化神經(jīng)樣細(xì)胞的功能

1.1 突觸聯(lián)系 神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)通路發(fā)揮正常電生理和分泌神經(jīng)遞質(zhì)最基本的解剖結(jié)構(gòu)是神經(jīng)突觸。Gomes等［4］證實(shí)BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子可誘導(dǎo)核仁內(nèi)RNA聚合酶－1（RNA polymerase－1）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1／2信號(hào)通路調(diào)控神經(jīng)元核仁轉(zhuǎn)錄，并通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控神經(jīng)軸突的生長、延長和分支。汪智卿等［5］用IL－1a體外誘導(dǎo)MSCs，突觸素染色陽性有表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生突觸聯(lián)系的功能。Cho等［6］利用突觸泡蛋白免疫染色和電生理研究證實(shí)，經(jīng)維甲酸處理的MSCs可產(chǎn)生突觸傳遞表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)PPT－1基因，表明MSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞具備可以分泌神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)突觸。Yang等［7］單用bFGF就可以有效的誘導(dǎo)BMSC分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，并隨神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP－43的增長此神經(jīng)樣細(xì)胞可以顯示出神經(jīng)元的特征性電生理現(xiàn)象和高水平的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物。此外該實(shí)驗(yàn)還通過干擾成纖維細(xì)胞因子受體（FGFR－1）的RNA和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）特異性抑制劑U0126證明BFGF主要通過激活骨髓干細(xì)胞中的FGFR－1受體和蛋白激酶－C通路而調(diào)節(jié)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，從而說明了信號(hào)傳導(dǎo)通路的可能性。這些研究都證明了誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞具備產(chǎn)生神經(jīng)功能最基本的神經(jīng)生理解剖結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和正常神經(jīng)電生理的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。

1.2 神經(jīng)遞質(zhì) 神經(jīng)細(xì)胞的主要特征是能合成和釋放神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控跨越其表面膜的離子流而產(chǎn)生電信號(hào)。目前一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞具備去甲腎上腺素（NE）分泌的功能。Chen等［8］用維甲酸和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)MSCs，并用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定、高效液相色譜法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，據(jù)NE的濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和每1×107個(gè)細(xì)胞的去甲腎上腺素濃度作為主要觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示：MSCs培養(yǎng)14d時(shí)神經(jīng)巢蛋白抗原表達(dá)陽性，20d時(shí)可見長突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞，神經(jīng)核蛋白也表達(dá)陽性。NE與峰面積之比有良好的線性關(guān)系，回歸率為92.39%。體外誘導(dǎo)分化的神經(jīng)樣細(xì)胞及培養(yǎng)液中NE隨時(shí)間相應(yīng)增加，對(duì)照組則為陰性。具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的γ－氨基丁酸（GABA）是廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，可促進(jìn)神經(jīng)前提細(xì)胞的成熟和遷移［9］。許燕等［10］用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和3，4－二羥基苯甲醚（butylated hydmxy lanisole，BHA）誘導(dǎo)人MSCs。RT－PCR檢測(cè)誘導(dǎo)3d后GABA－α2和GABA－α3的mRNA表達(dá)陽性，表明人MSCs在一定誘導(dǎo)條件下可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的GABA受體。施雪英等［10］采用三七總皂甙對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)后GABA也表達(dá)陽性，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)三七總皂甙能促進(jìn)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的橫向分化并明顯延長分化細(xì)胞的存活時(shí)間，抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl－2明顯增加，凋亡基因bax明顯減少。觀察在加入誘導(dǎo)劑三七總皂甙后2 h見細(xì)胞質(zhì)收縮，逐漸有突起形成；5h后多數(shù)細(xì)胞形成明顯的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，胞體呈圓形，突起較長，雙極或多極形，并在突起末端出現(xiàn)分支，部分相鄰細(xì)胞的突起連接成網(wǎng)；8～12h后神經(jīng)元特異性烯醇化酶有大量陽性表達(dá)，乙酰膽堿酯酶和γ－氨基丁酸均表達(dá)陽性。

人類的感覺、運(yùn)動(dòng)和行為等多種生理效應(yīng)與廣泛分布于腦組織內(nèi)的5－羥色胺能神經(jīng)節(jié)及5－羥色胺能神經(jīng)元所分泌的5－羥色胺作用于不同的受體亞型有關(guān)。其可促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成，在皮質(zhì)發(fā)育、突觸形成中起著重要作用［11］，是中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。陳劍榮等［12］用BDNF和維A酸對(duì)MSCs進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)，12d時(shí)見大而圓的細(xì)胞，Nestin抗原陽性；20d可見長突起神經(jīng)元樣細(xì)胞，神經(jīng)核蛋白（NeuN）檢測(cè)陽性。另外14d、20d的神經(jīng)元樣細(xì)胞及培養(yǎng)液均可檢測(cè)到5－羥色胺且隨時(shí)間增加其濃度也相應(yīng)增加。

乙酰膽堿促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化［13］，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（chAT）作為膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶是生成ACh的限速酶，常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或估計(jì)ACh含量（釋放量）的間接指標(biāo)。Woodbury等［14］發(fā)現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞是一種定量調(diào)控基因的表達(dá)而不是簡單的開－關(guān)神經(jīng)基因表達(dá)。MSCs不僅分化出中胚層神經(jīng)細(xì)胞的mRNA，還可分化出內(nèi)胚層和外胚層的基因，其分化的神經(jīng)樣細(xì)胞不僅具備微管蛋白－Ⅲ、神經(jīng)絲蛋白－M、神經(jīng)突觸蛋白等特殊標(biāo)記物的表達(dá)還可以分泌酪氨酸羥化酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶。

1.3 電生理特性 神經(jīng)細(xì)胞的離子電生理對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮正常生理效應(yīng)起著至關(guān)重要的作用。目前對(duì)于MSCs分化誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞電生理的實(shí)驗(yàn)研究均表明該細(xì)胞具備成熟神經(jīng)細(xì)胞的某些電生理特性。楊慧民等［15］用誘導(dǎo)劑（a－MEM，體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清，10μg／L堿性成纖維細(xì)胞生長因子）及誘導(dǎo)培養(yǎng)基（α－MEM，2%DMSD，200μmol／L丁羥茴醚）誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞50個(gè)中有25個(gè)ATP電流（50%）、13個(gè)GABA電流（26%）、46個(gè)總鉀電流（92%）、46個(gè)復(fù)極化鉀電流（92%）。充分說明在誘導(dǎo)分化的神經(jīng)樣細(xì)胞上存在功能性離子通道，具備電生理特性。Jiang等［16］用BDNF、BFGF等細(xì)胞因子及細(xì)胞共培養(yǎng)等方法誘導(dǎo)分化的神經(jīng)樣細(xì)胞可長時(shí)間存活且表現(xiàn)出更為成熟的神經(jīng)元形態(tài)。利用膜片鉗記錄出的大量數(shù)據(jù)，顯示共培養(yǎng)5d后的神經(jīng)元樣細(xì)胞有22%的細(xì)胞能激發(fā)出可能與鈉離子電壓門控通道有關(guān)的峰電位，7～12d時(shí)高達(dá)80%～100%的細(xì)胞具備這種電生理特性，未共培養(yǎng)細(xì)胞則無此電生理特性。此特性與正常中腦神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)和電生理特性極為相似。Kohyama等［17］報(bào)道N－5雜胞苷與Noggin可誘導(dǎo)MSCs分化為功能成熟具有電生理特點(diǎn)的神經(jīng)樣細(xì)胞，膜片鉗技術(shù)監(jiān)測(cè)到的負(fù)相電流提示電壓依賴性鉀通道的存在，且加入乙酰膽堿后細(xì)胞出現(xiàn)快速可逆的Ca2＋內(nèi)流。Noggin誘導(dǎo)后28d細(xì)胞外鉀和谷氨酸鹽水平升高，胞漿Ca2＋也迅速可逆性增加。

Mareschi等［18］用多種誘導(dǎo)方案體外誘導(dǎo)MSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞電生理功能檢測(cè)可見兩股與鉀通道相關(guān)的延遲整合鉀離子流，這是細(xì)胞負(fù)性靜息電位以及基本功能活性的維持所必須的。胡琳燕等［19］采用丹參對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并利用細(xì)胞膜電位特異性的熒光探針DiBAC4（3）標(biāo)記細(xì)胞，該方法可以在不損傷細(xì)胞膜的基礎(chǔ)上更精確、更便捷地反應(yīng)細(xì)胞的膜電位變化趨勢(shì)。另外共聚焦檢測(cè)細(xì)胞受高鉀刺激的熒光變化顯示：MSCs在第4次誘導(dǎo)后1h時(shí)NF表達(dá)率（95.3±1.6）%；5h后在高鉀刺激下發(fā)生去極化，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度瞬時(shí)增強(qiáng)，而空白對(duì)照無反應(yīng)。蘇平等用銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)大鼠MSCs為神經(jīng)樣細(xì)胞，并利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子通道電流，顯示該神經(jīng)樣細(xì)胞除見鉀電流IK外，還可見外向整流IA，類似神經(jīng)元對(duì)照。說明銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)的MSCs，不僅具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和免疫特性，還具備神經(jīng)電生理功能。

2 問題與展望

雖然在MSCs誘導(dǎo)分化為具有正常生理功能的神經(jīng)細(xì)胞方面已經(jīng)具備了很多實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但仍有很多問題需待進(jìn)一步研究：（1）如何有效獲得比較純的MSCs，不同分化階段的MSCs細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)和細(xì)胞標(biāo)志仍然沒有非常特異的標(biāo)記物；（2）如何更有效提升MSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的成活率分化率；（3）MSCs跨胚層誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚；（4）誘導(dǎo)分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的鑒定及功能檢測(cè)還需進(jìn)一步的研究；（5）神經(jīng)遞質(zhì)以及神經(jīng)遞質(zhì)受體在MSCs增殖和分化中的信號(hào)傳導(dǎo)也需進(jìn)一步深入研究。

由于MSCs來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并具有潛在多向分化潛能，作為傳統(tǒng)不可再生細(xì)胞的種子細(xì)胞具有諸多優(yōu)點(diǎn)，雖然目前還有許多問題尚未破曉，但相信隨著研究的深入，MSCs一定會(huì)在未來再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。

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