針刺結(jié)合抗癇靈對癲癇大鼠海馬GABAA R的影響

孫 麗，馮鐵為，李敬孝

(1.大慶龍南醫(yī)院齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院，黑龍江大慶163453;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，發(fā)生機(jī)制迄今尚未完全闡明?？拱d癇西藥有明顯的毒副作用等局限性。近年有研究表明，中醫(yī)藥及針灸有緩效、作用時間長、毒性反應(yīng)和副作用少的優(yōu)勢，本實(shí)驗(yàn)通過針?biāo)幗Y(jié)合觀察對戊四氮(PTZ)致癲癇大鼠癲癇發(fā)作強(qiáng)度的影響，以及癲癇海馬區(qū)的GABAAR的表達(dá)變化。為中醫(yī)藥治療癲癇提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物分組

實(shí)驗(yàn)動物采用4～6周健康雄性Wistar大鼠50只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。體重180～220 g，隨機(jī)分成5組?？瞻捉M6只，癲癇模型組、抗癇靈處理組、針刺結(jié)合抗癇靈處理組、丙戊酸鈉(VPA)處理組各11只。

1.2 癲癇動物模型及給藥方法

每日固定時間予除空白組以外其余大鼠進(jìn)行腹腔注射戊四氮(PTZ，購于Sigma公司)造模，PTZ用生理鹽水配成2 mg/ml溶液，劑量以亞致痙量35.0 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)。癲癇模型組和空白組大鼠均予以相應(yīng)劑量生理鹽水灌胃，抗癇靈組、VPA組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，其中抗癇靈為導(dǎo)師李敬孝臨床常用治療癲癇的有效方劑，藥物組成為穿山甲、乳香、沒藥、龍骨、珍珠、膽南星、石菖蒲。針刺結(jié)合抗癇靈組每日定時灌胃給藥1次，按照動物穴位定位［1］，針刺百會穴快速進(jìn)針，留針30 min，運(yùn)動區(qū)［2］，取雙側(cè)采取橫刺快速進(jìn)針，在30 min內(nèi)捻針3次，每次1 min，頻率為200轉(zhuǎn)/min以上，30 min以后出針。隔日1次。各實(shí)驗(yàn)組大鼠給予相應(yīng)灌胃6周時間。實(shí)驗(yàn)期間各組均以普通飼料及自由飲水。灌服藥物的劑量按正常成人(70 Kg)與大鼠給藥劑量系數(shù)0.018折算：臨床丙戊酸鈉用量一般為20～30 mg/kg，取其中間值25 mg/kg的劑量，折算成大鼠的灌胃劑量為15.75 mg/kg。

1.3 癲癇發(fā)作行為觀察

觀察每只大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作的潛伏期、持續(xù)時間、癲癇發(fā)作的強(qiáng)度，每只大鼠ipPTZ后觀察2 h。大鼠癲癇發(fā)作評分標(biāo)準(zhǔn)［2］：0級：無行為上的發(fā)作反應(yīng);Ⅰ級：節(jié)律性點(diǎn)頭或頭面部抽動;Ⅱ級：陣攣性咀嚼或點(diǎn)頭甩尾;Ⅲ級：頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級：袋鼠姿勢或多肢抽動;Ⅴ級：全面性持續(xù)強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。造模大鼠連續(xù)出現(xiàn)5天Ⅱ級以上癲癇發(fā)作者，證明造模成功。在大鼠造模成功后，停止PTZ腹腔注射。

1.4 Western blot方法檢測大鼠海馬中的GABAAR相對表達(dá)

經(jīng)過蛋白提取后，確定蛋白質(zhì)的不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，取待測樣品與6×樣品緩沖液按1：5混勻后于沸水浴中煮沸5 min，置室溫冷卻。轉(zhuǎn)膜印跡在避光條件下，加入堿性磷酸酶的特異性底物溶液，直至出現(xiàn)清晰的特異性條帶。立即將膜浸入去離子水中，漂洗幾分鐘。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間，模型組死亡1只，抗癇靈組死亡2只。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時各組大鼠為：空白組6只、模型組10只、VPA組11只、抗癇靈組9只、針刺結(jié)合抗癇靈組11只。在治療結(jié)束后，各組大鼠體重、手色與空白組相比，無明顯差異。

2.2 行為觀察

在腹腔注射戊四氮7天后，各組大鼠均有出現(xiàn)癲癇發(fā)作，呈Ⅱ、Ⅲ級發(fā)作為主要表現(xiàn)，個別發(fā)作達(dá)V級。在造模進(jìn)入第4周后，癲癇發(fā)作平均持續(xù)時間又有明顯的延長，表明大部分大鼠已造模成功。見表1。

表1 戊四氮誘導(dǎo)41只大鼠癲癇發(fā)作行為觀察(s)

表1 戊四氮誘導(dǎo)41只大鼠癲癇發(fā)作行為觀察(s)

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從實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作時的潛伏期和持續(xù)時間明顯比在Ⅰ～Ⅲ級發(fā)作時的潛伏期和持續(xù)時間長。在Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作時潛伏期均在2～10 min之間，持續(xù)時間在0.5～3 min之間，在Ⅰ～Ⅲ級發(fā)作時的潛伏期均在2～30 min之間，持續(xù)時間在15～60 min。

2.3 大鼠海馬中的GABAAR蛋白相對表達(dá)比較

表2 各組大鼠腦組織中海馬GABAAR蛋白表達(dá)比較(s)

表2 各組大鼠腦組織中海馬GABAAR蛋白表達(dá)比較(s)

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表2示：模型組大鼠海馬中GABAAR蛋白陽性表達(dá)顯著降低，與空白組比較具有顯著性差異(P＜0.01);VPA組、抗癇靈組、針刺結(jié)合抗癇靈組的GABAAR蛋白陽性表達(dá)較模型組增加，差異性顯著(P ＜0.05)。

3 討論

癲癇在中醫(yī)學(xué)中稱為“癇癥”，俗稱“羊癲風(fēng)”。中醫(yī)學(xué)理論有對癲癇的病因病機(jī)的明確闡述，既有先天稟賦不足引起，也有后天失養(yǎng)或產(chǎn)傷、顱腦外傷、情志失調(diào)病因，導(dǎo)致心、肝、脾諸臟受損，產(chǎn)生風(fēng)、火、癖、痰病理產(chǎn)物使氣血逆亂，風(fēng)火相煽，走竄經(jīng)絡(luò)，痰凝氣滯，蒙閉清竅，引起癲癇發(fā)作，以風(fēng)、火、痰為主，多屬實(shí)證;病久不愈，反復(fù)發(fā)作，正氣損傷，由實(shí)轉(zhuǎn)虛，多為虛中夾實(shí)之證。正氣虛，風(fēng)痰氣滯，病邪深入，病情反復(fù)難愈，治療亦較困難?？拱B靈沖劑由穿山甲、乳香、沒藥、龍骨、珍珠、膽南星、石菖蒲組成。通過用藥配伍有豁痰、化瘀、開竅、鎮(zhèn)驚、安神、熄風(fēng)功效，針對癲癇的病因病機(jī)癥狀治療。筆者曾先期做過系列抗癇靈的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示：抗癇靈可有效的對抗戊四氮致癲癇大鼠癲癇發(fā)作強(qiáng)度，顯著降低氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酚合成前體谷氨酸(GLu)受體n一甲基天冬氨酸受體(NMDA)的活性，從而可治療和控制癲癇發(fā)作?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是腦內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Y-氨基丁酸(GABA)與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和/或天門冬氨酸(Glu/ASp)作用失衡，破壞中樞神經(jīng)元突觸傳遞所至。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最具有代表性的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元興奮性的改變，異常放電的過程中起著非常重要的作用。GABA可以通過作用于GABAAR而抑制Glu的釋放［3］，抑制癲癇發(fā)作。本次研究結(jié)果顯示，抗癇靈能明顯增強(qiáng)戊四氮誘導(dǎo)癲癇大鼠腦內(nèi)海馬中GABAAR表達(dá)，與模型組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義。戊四氮致癇模型是一種理想的全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作動物模型，針灸可抑制癲癇放電，改善異常腦電圖，起到抗癲癇發(fā)作的功效。針刺治療增高腦內(nèi)GABA蛋白含量［4］，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，提高癲癇患者的免疫球蛋白，降低乙酞膽堿(Ach)含量，調(diào)整腦內(nèi)阿片物質(zhì)釋放，增加腦內(nèi)單胺類物質(zhì)，這些都對臨床針刺治療癲癇獲得很好療效提供了重要的科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示針刺結(jié)合抗癇靈治療對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有較強(qiáng)的抑制作用，能減少大鼠的自由活動數(shù)，拮抗戊四氮所致大鼠驚厥，抑制大鼠電驚厥的發(fā)生率，不失為治療癲癇的好方法。

［1］ 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004

［2］ 郭有昌，關(guān)國英.中國針灸治療事典［M］.哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1992：227

［3］ Martina EV，Uta R，Peter M，et al.Penty enetetra zole(PTZ)-induced c-fos expression in the hippocampus of kinedled rats in suppressed by concomitant treatment with Naoxone［J］.Brain Res，1998，792(3)：299-308

［4］ Seyed M，Mirsattari.EEG Monitoring during Funetional MRI in Animal Models［J］.Epilepsia，2007，48(S4)：37-46