流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

張 韞，楊 鑫，李 忻

（中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所 中心實(shí)驗(yàn)室,北京 100029）

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是近代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)等高度結(jié)合和發(fā)展的結(jié)晶，是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他細(xì)胞粒子、抗原物質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)分析和分選的技術(shù)[1]。FCM結(jié)合現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)，可同時(shí)鑒別單個(gè)細(xì)胞上的多種參數(shù)定量定性分析，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。使用FCM能夠快速分析單個(gè)細(xì)胞或粒子的多種特性，既可以定性也可以定量，尤其適用于大量樣品檢測(cè)，已在臨床檢驗(yàn)工作中得到廣泛應(yīng)用。FCM的檢測(cè)分析已涉及到腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科[2]。筆者對(duì)FCM在臨床檢驗(yàn)工作中的應(yīng)用作一綜述。

1 FCM的工作原理及分型

FCM的結(jié)構(gòu)一般分為5部分：①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；②激光光源及成形系統(tǒng)；③光學(xué)系統(tǒng)；④信號(hào)檢測(cè)、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)[3]。FCM的特點(diǎn)：①快速，最高每秒可測(cè)數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；②進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)測(cè)量，可根據(jù)測(cè)量信息對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選。其原理是把經(jīng)熒光染料標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞樣品制成單細(xì)胞懸液，由氣壓裝置送入流動(dòng)室，流動(dòng)室由供試品管和鞘液管組成，鞘液管充滿流的鞘液，鞘液流與供試品流壓力不等，當(dāng)兩者壓力差達(dá)到一定程度時(shí)，鞘液裹挾著供試品流迫使細(xì)胞有序地排列成單列，逐個(gè)通過(guò)噴嘴進(jìn)人這些染料將在通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)時(shí)受激光束激發(fā)，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)，通過(guò)一些波長(zhǎng)選擇通透性濾光片，用不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)組分的含量呈正比。熒光信號(hào)和散射光信號(hào)經(jīng)過(guò)光電倍增管和光電探測(cè)器接收后轉(zhuǎn)換成電脈沖，送入計(jì)算機(jī)處理，應(yīng)用不同的分析軟件可分析樣品的各種參數(shù)，最后以直方圖或二維圖的形式顯示出來(lái)，還可以用不同的熒光標(biāo)記物進(jìn)行單參數(shù)、雙參數(shù)、甚至多參數(shù)的分析[4]。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同的特征，如細(xì)胞大小、DNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)、癌基因蛋白等。

FCM一般分為科研型和臨床型兩種。科研型FCM功能齊全，分析靈活，但操作比較繁瑣，必須由經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作；臨床型FCM易于操作，穩(wěn)定性好，分析速度快，適合在臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。對(duì)某種特征的細(xì)胞，還可利用科研型FCM的分選功能將其分選出來(lái)，進(jìn)行培養(yǎng)或其他處理，做更深入的研究[5]。

2 FCM在臨床中的應(yīng)用

2.1 在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

FCM在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用主要是利用DNA含量測(cè)定進(jìn)行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評(píng)估等工作。惡性腫瘤的早期診斷是提高治愈率和生存率的關(guān)鍵，良惡性腫瘤的鑒別診斷對(duì)于確定臨床治療方案具有決定性作用。迄今為止病理形態(tài)學(xué)診斷一直被視為腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于某些腫瘤，特別在早期缺乏客觀明確的診斷指標(biāo)，不能提高診斷的正確率[6]。

FCM的出現(xiàn)給腫瘤的病理學(xué)診斷帶來(lái)了飛躍，特別是用FCM分析細(xì)胞DNA含量，分辨率高、精確度好，可為判斷腫瘤的生物學(xué)行為提供客觀而準(zhǔn)確的資料，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。癌前病變是指某些具有癌變潛能的病變，正確識(shí)別癌前病變對(duì)早期診斷和預(yù)防惡性腫癌具有重要的實(shí)際意義。然而臨床上所謂癌前病變所包括的實(shí)際上是一大組生物學(xué)行為迥異的病變，其中一小部分具潛在癌變可能，而大部分完全是良性病變，因此要用病理形態(tài)學(xué)手段將其區(qū)別開(kāi)來(lái)。只有那些不典型增生或稱異型增生的上皮具癌變潛能，為了進(jìn)一步區(qū)別不典型增生上皮癌變潛能的大小，通常根據(jù)其增生程度和形成表現(xiàn)將其分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)，分級(jí)越高，惡變可能性越大。DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個(gè)重要指標(biāo)。FCM可精確定量DNA含量的改變，即檢測(cè)出DNA非整倍體的出現(xiàn)，并將其作為診斷癌前病變發(fā)展至癌變中的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志，從而對(duì)癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)做出評(píng)估，有助于癌變的早期診斷[7]。其具體方法是先將實(shí)體瘤組織解聚、分散制備成單細(xì)胞懸液，再用熒光染料（碘化吡啶PI）染色后對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行分析，最后將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成3個(gè)亞群 （G0/G1期、S期、G2期），DNA含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)，非倍體細(xì)胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。DNA非整倍體細(xì)胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力證據(jù)[8]。有資料證實(shí)，癌前病變的癌變發(fā)生率與細(xì)胞不典型增生程度有密切關(guān)系，增生程度越重，癌變發(fā)生率越高。

FCM不僅可以對(duì)惡性腫瘤DNA含量進(jìn)行分析，還可根據(jù)化療過(guò)程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評(píng)估療效，了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化，在腫瘤化療方面的意義尤為顯著。臨床工作人員可根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，結(jié)合化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論，設(shè)計(jì)最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細(xì)胞的殺傷變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，選取有效藥物以使對(duì)腫瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果[9]。

2.2 FCM在免疫學(xué)中的應(yīng)用

利用抗原抗體特異性反應(yīng)原理，將不同單克隆抗體設(shè)法帶上各種熒光染料作為熒光標(biāo)記（熒光探針），這種熒光探針與單克隆抗體能牢牢結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞被激光器發(fā)射的激光照射后，細(xì)胞膜的抗原抗體復(fù)合物上的熒光探針可以發(fā)射出不同光譜的激發(fā)熒光，帶熒光探針的單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的結(jié)合的繼發(fā)熒光量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，這就代表了細(xì)胞表面的抗原量。這些熒光通過(guò)FCM的識(shí)別和分辨，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面抗原的定量檢測(cè)[10]。細(xì)胞免疫反應(yīng)一般分2種：（1）直接免疫反應(yīng)：即細(xì)胞表面抗原與帶熒光探針的單克隆抗體特異結(jié)合的免疫反應(yīng)；（2）間接免疫反應(yīng)：細(xì)胞表面的抗原與單克隆抗體結(jié)合，帶熒光的第二抗體又與抗體結(jié)合，也使這個(gè)抗原-抗體復(fù)合物也帶上熒光探針[11]。

機(jī)體免疫狀態(tài)是機(jī)體是否罹患疾病的重要指標(biāo)，目前多采用FCM來(lái)監(jiān)測(cè)機(jī)體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標(biāo)是 T、B和 NK淋巴細(xì)胞的水平。T細(xì)胞主要包括 Th和Ts細(xì)胞亞群。CD3細(xì)胞代表外周血中總的成熟 T細(xì)胞，理論上應(yīng)約等于CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的總和。但我們檢測(cè)患者T細(xì)胞及其亞群時(shí)，往往出現(xiàn)CD4+加 CD8+細(xì)胞之和大于CD3的情況。這是因?yàn)镃D4+細(xì)胞其實(shí)包括兩部分：CD3+/CD4+細(xì)胞（真正的 Th細(xì)胞）和 CD3-/CD4+細(xì)胞（非Th細(xì)胞）；CD8細(xì)胞也包括兩部分細(xì)胞：CD3+/CD8+細(xì)胞（真正 Ts細(xì)胞）和 CD3-/CD8+細(xì)胞（非 Ts細(xì)胞）。而CD3-/CD8+細(xì)胞又可以分為兩組：一組為CD3-/CD8+/CD（16+56）+細(xì)胞（即 NK細(xì)胞的一部分）；另一組為 CD3-/CD8+/CD（16+56）-（一群未知細(xì)胞）。由此可見(jiàn)，真正的 Th細(xì)胞是CD3+/CD4+細(xì)胞，真正Ts細(xì)胞是 CD3+/CD8+細(xì)胞。若使用CD4或CD8單標(biāo)單抗或CD4與CD8雙標(biāo)抗體來(lái)檢測(cè) Th和 Ts，而不用 CD3抗體進(jìn)行限定，測(cè)出的結(jié)果必然會(huì)偏離真實(shí)值。尤其當(dāng)患者NK細(xì)胞明顯增加時(shí)，會(huì)使CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞的總和遠(yuǎn)大于CD3+細(xì)胞。因此，一定用三色熒光標(biāo)記才能分析真正的輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞。首先在淋巴細(xì)胞中識(shí)別出CD3細(xì)胞，然后在 CD3細(xì)胞中再區(qū)分 CD4+和 CD8+細(xì)胞[12]。

自然殺傷細(xì)胞（NK），又稱裸細(xì)胞，因其表面沒(méi)有類似T細(xì)胞和B細(xì)胞的表面標(biāo)志。后來(lái)隨著免疫力學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了 NK細(xì)胞的一些表面標(biāo)志，如CD16、CD56等，但單用 CD16和CD56的抗體無(wú)法正確鑒定出 NK細(xì)胞，因此必須使用 CD（16+56）抗體。這里還有一點(diǎn)必須引起足夠重視，即 NK細(xì)胞一定是 CD3陰性表達(dá)細(xì)胞。所以CD3-/CD（16+56）+細(xì)胞才是真正的 NK細(xì)胞[13]。

B細(xì)胞的表面標(biāo)志是CD19，理論上CD3-/CD19+細(xì)胞才是真正的 B淋巴細(xì)胞。但實(shí)際檢測(cè)中，CD3+/CD19+細(xì)胞很少，可以忽略不計(jì)，所以 CD19+細(xì)胞就是 B淋巴細(xì)胞[14]。

FCM與單克隆抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體的定量檢測(cè)取得很大的進(jìn)展，克服了普通免疫學(xué)方法難以準(zhǔn)確定量的不足。這一技術(shù)對(duì)于人體細(xì)胞免疫功能的評(píng)估有重要意義。通過(guò)檢測(cè)各種免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子等，通過(guò)對(duì)患者淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測(cè)定來(lái)監(jiān)控患者的免疫狀態(tài)，指導(dǎo)治療。FCM通過(guò)對(duì)人白細(xì)胞抗原配型的測(cè)定可以為異體干細(xì)胞移植患者選擇出最合適的供體并進(jìn)行骨髓或器官移植后免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)[15]。此外，用FCM檢測(cè)紅細(xì)胞、粒細(xì)胞抗體及血小板減少性疾病，均有檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[16]。

2.3 FCM在血液學(xué)中的應(yīng)用

在臨床診斷中，一般通過(guò)采集血液或者骨髓為標(biāo)本進(jìn)行診斷，因?yàn)檠夯蛘吖撬璧牟杉容^方便，而且采集的標(biāo)本呈懸浮狀態(tài)，易于FCM分析、分選等，因而血液學(xué)也是FCM重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一[17，18]。

FCM通過(guò)對(duì)外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測(cè)分析，對(duì)白血病、淋巴瘤等各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。FCM采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細(xì)胞的屬性。各種血細(xì)胞系統(tǒng)都具有其獨(dú)特的抗原，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時(shí)，免疫表型參數(shù)對(duì)各種急性白血病、淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用，其診斷的準(zhǔn)確性可達(dá)到90%左右。微小殘留病變 （minimal residual disease，MRD）是白血病復(fù)發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM能在患者緩解期檢測(cè)是否有殘留病變細(xì)胞，及早發(fā)現(xiàn)后采取措施避免復(fù)發(fā)。而且測(cè)定DNA倍體和進(jìn)行細(xì)胞周期分析對(duì)指導(dǎo)白血病化療也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細(xì)胞增殖狀況不同，定期了解細(xì)胞增殖情況采取相應(yīng)藥物可以提高療效。急性白血病的多耐藥基因也常用FCM檢測(cè)，F(xiàn)CM特有的敏感性和特異性，用于檢測(cè)二氨基苯茚酮mRNA的表達(dá)產(chǎn)物P糖蛋白及其活性（作為藥物的排出泵,降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度），可以更直接的反映耐藥程度[19～21]。

網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標(biāo)。FCM通過(guò)某些熒光染料 （吖啶橙等）與紅細(xì)胞中RNA結(jié)合,定量測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞中RNA,得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比。有報(bào)道認(rèn)為FCM比目測(cè)法的精確度更高。此外,FCM還可以測(cè)量出網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟度,對(duì)紅細(xì)胞增殖能力的判斷很有意義,為干細(xì)胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測(cè)、腫瘤患者放、化療對(duì)骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)[22，23]。

此外，血小板活化時(shí)其細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測(cè)定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測(cè)的非免疫性指標(biāo)。免疫性血小板減少性紫癜患者血漿中可以產(chǎn)生血小板自身抗體，結(jié)合在血小板表面，稱為血小板相關(guān)抗體（IgG、IgA或IgM分子），用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標(biāo)記被測(cè)血小板，運(yùn)用FCM能檢測(cè)出血小板相關(guān)抗體含量。該方法用于該病的診斷及治療監(jiān)測(cè)具有檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[24]。

2.4 FCM在臨床微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

FCM快速、靈敏以及可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)分析的優(yōu)點(diǎn)，使其在臨床微生物檢測(cè)中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。通過(guò)熒光染料標(biāo)記，不僅可以檢測(cè)病原菌、毒素和血清抗體，還可用于抗生素敏感性試驗(yàn)，對(duì)抗生素后效應(yīng)、細(xì)菌耐藥的異質(zhì)性等進(jìn)行分析。FCM既可用于檢測(cè)受染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原,也可檢測(cè)受染細(xì)胞表面的病毒抗原。利用可特異性識(shí)別細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的單克隆抗體,FCM可快速檢測(cè)并定量受染細(xì)胞。常用的有直接和間接熒光抗體技術(shù),前者用熒光標(biāo)記特異性單克隆抗體,后者用未標(biāo)記的一抗與受染細(xì)胞中的抗原結(jié)合,然后再將熒光標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合。由于FCM檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞,因此FCM檢測(cè)受染細(xì)胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標(biāo)本以及經(jīng)酶消化過(guò)的組織細(xì)胞。同時(shí)由于FCM為多參數(shù)分析,因此將其用于病毒檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)：可在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)獲得多個(gè)分析參數(shù)；能定量檢出受染細(xì)胞。當(dāng)用不同熒光染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時(shí),FCM可同時(shí)檢測(cè)到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原。這種方法也可用于真菌、寄生蟲(chóng)、病毒以及這些病原體混合感染的檢測(cè)[25]。

FCM體外抗生素藥敏試驗(yàn)的主要機(jī)制是，通過(guò)FCM檢測(cè)染料與病原體結(jié)合后發(fā)出的不同熒光強(qiáng)度，間接反映病原體的活性和功能狀態(tài)，進(jìn)而幫助判斷病原體對(duì)抗生素的反應(yīng)性。用于研究抗菌效應(yīng)的熒光染料主要有2大類：（1）標(biāo)記DNA和RNA的染料，如碘化丙啶（PI）、溴化乙錠（EB）等；（2）反映代謝活性或結(jié)合蛋白的探針，包括膜電位敏感性染料、異硫氰酸熒光素（FITC）等。這些物質(zhì)的選擇與其激發(fā)與發(fā)射特性有關(guān)，同時(shí)也與抗生素的作用機(jī)制有關(guān)[26]。近年來(lái),FCM用于細(xì)菌的藥敏效應(yīng)研究已有較大發(fā)展,FCM與熒光染料的聯(lián)合運(yùn)用可判斷細(xì)菌活力和功能狀態(tài),由于速度快,該方法已被建議用作臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)藥敏試驗(yàn)[27]。

3 展望

FCM以其分辨率高、分辨細(xì)胞數(shù)量大、參數(shù)多、準(zhǔn)確性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中，并逐步成為醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中極具發(fā)展?jié)摿Φ母呒夹g(shù)平臺(tái)。隨著流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法的迅速發(fā)展，F(xiàn)CM在臨床的應(yīng)用范圍也不斷拓展，并將成為推動(dòng)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段之一。

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