培養(yǎng)基成分對(duì)藥用真菌多糖的影響

鄒芒閣，付 堯，任 昂

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014)

引言

藥用真菌，是指能治療疾病、具有藥用價(jià)值的一類真菌。我國(guó)的真菌資源非常豐富，傳統(tǒng)藥用及試驗(yàn)證明具有藥效的真菌已超過400種，主要集中在擔(dān)子菌亞門和子囊菌亞門[1]。藥用真菌具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括多糖（胞內(nèi)多糖ESP、胞外多糖ISP）、萜類、蟲草菌素等多種活性物質(zhì)，是人們尋找新型藥物的重要資源。多糖是一類重要的藥用真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有降血糖、增強(qiáng)系統(tǒng)免疫等方面的作用，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上具有重要價(jià)值。

藥用真菌生長(zhǎng)繁殖以及代謝均需要環(huán)境提供營(yíng)養(yǎng)因子，一旦某種營(yíng)養(yǎng)因子缺失或不足，真菌的生命活動(dòng)就將受到影響。本文從培養(yǎng)基成分角度綜述了碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)、植物油、真菌激發(fā)子對(duì)藥用真菌多糖產(chǎn)生的影響。

1 藥用真菌多糖研究概況

藥用真菌多糖是一類從藥用真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離提取出來(lái)的代謝產(chǎn)物多糖?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藥用真菌多糖具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等，且具有安全無(wú)毒副作用的優(yōu)越性[2]。

目前藥用真菌多糖的生產(chǎn)工藝主要包括子實(shí)體直接提取法以及液體深層發(fā)酵技術(shù)[3]。子實(shí)體直接提取法的人工栽培周期長(zhǎng)，且容易受雜菌污染、病蟲害侵蝕，多糖得率低[4]，遠(yuǎn)不能滿足臨床和保健需求；液體深層發(fā)酵技術(shù)的生產(chǎn)周期短，染菌少，但對(duì)菌種本身的多糖產(chǎn)量有一定的要求。目前，大多數(shù)藥用真菌菌種多糖產(chǎn)量低，難以滿足液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的需要，如何提高菌種的多糖產(chǎn)量是藥用真菌多糖大規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)瓶頸。

近年來(lái)，大量的國(guó)內(nèi)外研究表明培養(yǎng)基成分與菌種的多糖生物合成量有直接的關(guān)系。如Malinowska等人[5]研究表明培養(yǎng)基成分對(duì)多糖的合成有顯著影響，Guo等人[6]研究表明培養(yǎng)基成分的優(yōu)化選擇能顯著提高多糖的產(chǎn)量。因此，從培養(yǎng)基成分角度來(lái)提高菌種多糖生物合成量對(duì)藥用真菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)多糖具有重大意義。

2 培養(yǎng)基成分對(duì)藥用真菌多糖的影響

培養(yǎng)基是藥用真菌直接生活的外界環(huán)境，為真菌生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物提供原料。培養(yǎng)基的成分，如碳源、氮源、碳氮比、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)、植物油、真菌激發(fā)子等，對(duì)藥用真菌菌絲體的生長(zhǎng)繁殖、次級(jí)代謝產(chǎn)物多糖的生物合成量及其質(zhì)量都有重要影響[7]。

2.1 碳源

碳源是維持藥用真菌生長(zhǎng)的重要能量來(lái)源，也是藥用真菌合成多糖等次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要原料。藥用真菌能利用的碳源非常廣泛，單糖、雙糖、多糖以及天然農(nóng)副產(chǎn)品都能利用[8,9]，陳才法等[10]報(bào)道有機(jī)碳源對(duì)藥用真菌ESP的累積作用遠(yuǎn)大于無(wú)機(jī)碳。對(duì)于大多數(shù)藥用真菌而言，以葡萄糖為碳源時(shí)產(chǎn)多糖能力最強(qiáng)[8,9,11]。原因可能在于葡萄糖是單糖，能被菌體直接吸收，菌體生長(zhǎng)代謝速度快，而其它的二糖或多糖必須先變成單糖才能被菌體利用，生長(zhǎng)代謝速度慢[12]。少數(shù)藥用真菌合成多糖的優(yōu)勢(shì)碳源不是葡萄糖，如樺褐孔菌 (Inonotus obliquus)以麥芽糖為碳源時(shí)，ESP產(chǎn)量達(dá)2.75 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它碳源[10]。而香菇 (Lentinus edodes)的菌絲在富營(yíng)養(yǎng)化條件下可以積累香菇多糖[13]，大豆粉是靈芝 (Ganoderma lucidum)發(fā)酵生產(chǎn)最經(jīng)濟(jì)的碳源[14]。此外，包埋于藻酸鈣玻璃粉末中的真菌細(xì)胞，以葡萄糖或蔗糖為碳源發(fā)酵時(shí)，可以有兩個(gè)多糖合成周期[15]。

2.2 氮源

氮源是藥用真菌合成蛋白質(zhì)、核酸及其它代謝產(chǎn)物必不可少的原料。它不僅影響菌絲體的生物量，還影響著生物活性物質(zhì)的形成。藥用真菌能利用的氮源種類很多，有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源都能被利用。但單一的無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)和ESP的分泌不利[8]，有機(jī)氮源更有利于提高藥用真菌多糖的生物產(chǎn)率[8-11,16]。這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、游離的氨基酸以及少量的脂肪、微量元素和生長(zhǎng)素等，有利于菌體的生長(zhǎng)和各種代謝產(chǎn)物的合成[10,17]。大部分藥用真菌合成多糖所對(duì)應(yīng)的最適氮源是蛋白胨，小部分藥用真菌例外，如樟芝 (Antradia comphora)的最適氮源是酵母膏[16]。

2.3 碳氮比

碳氮比對(duì)藥用真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物多糖的合成也有一定的影響。碳氮比，主要影響營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)入菌體后的代謝流向，只有適宜的碳氮比才有利于藥用真菌多糖的合成[11,18]。不同種類的藥用真菌，其最適碳氮比不同。桑黃 (Phellinus baumii)在碳氮比為1:1的條件下，ISP有最大產(chǎn)量2.70 g·L-1[19]。 靈芝 (Ganoderma lucidum)產(chǎn)ISP的最適碳氮比在18左右，產(chǎn)ESP的最適碳氮比在25左右[20]。在低氮源情況下多糖產(chǎn)量隨碳源含量的增加而提高，在高氮源含量情況下碳源含量的改變對(duì)多糖合成沒有顯著影響[21]。

2.4 無(wú)機(jī)鹽

無(wú)機(jī)鹽是藥用真菌生長(zhǎng)、發(fā)育必不可少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]，其在菌體中的生理功能主要是作為酶活性中心的組成部分以及維持生物大分子、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。無(wú)機(jī)鹽的種類和添加量對(duì)藥用真菌菌絲生物量和多糖產(chǎn)量有著顯著的影響[19]。NH4Cl能提高冬蟲夏草 (Cordyceps sinensis)發(fā)酵液中 ESP、蟲草素的產(chǎn)量[23]。NaCl濃度能影響桑黃(Phellinus baumii)多糖的生物合成[24]，其ISP的產(chǎn)量隨NaCl濃度在1 g·L-1~7 g·L-1范圍內(nèi)的升高而降低，但ESP隨NaCl濃度在1 g·L-1~3 g·L-1范圍內(nèi)的升高而增加[25]。無(wú)機(jī)鹽KH2PO4對(duì)黑木耳 (Auricularia auricula)菌體生長(zhǎng)稍有抑制作用，但對(duì)ESP的分泌卻有顯著的促進(jìn)作用[8]。Selol能增加猴頭菇 (Hericium erinaceum)EPS、IPS中營(yíng)養(yǎng)元素硒的含量[26]。金屬離子及其濃度對(duì)中國(guó)塊菌 (Chinese truffle Tuber sinense)多糖有顯著的影響，50mM Mg2+被證明是其產(chǎn)多糖的最適濃度[27]。此外，靈芝 (G.lucidum)深層發(fā)酵中，添加Cu2+能使細(xì)胞的生長(zhǎng)、生物活性代謝產(chǎn)物的總積累有明顯的改善、增加[28]。

2.5 生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)

能促進(jìn)藥用真菌菌絲生長(zhǎng)、多糖合成的物質(zhì)種類很多。硫胺素、生物素、維生素、嘌呤等物質(zhì)作為細(xì)胞生命活動(dòng)中輔酶成分，具有重要的催化功能，對(duì)藥用真菌多糖的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用[18,29]。羧甲基纖維素鈉，能增加培養(yǎng)液黏度，促進(jìn)真菌多糖合成、菌絲生長(zhǎng)[29]。天然物質(zhì)如玉米漿、干燥的可溶性谷物水提取物，因?yàn)榭赡芎芯S生素、生物素、嘌呤等物質(zhì)，也能促進(jìn)藥用真菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生[18,30]。

2.6 植物油

植物油，是藥用真菌發(fā)酵液中的消泡劑，對(duì)藥用真菌細(xì)胞增長(zhǎng)、生物活性物質(zhì)的合成有一定的影響。作用機(jī)理可能與其作用于真菌細(xì)胞壁，使其通透性改變有關(guān)[29]。Chienyan等人[30]報(bào)道添加適當(dāng)?shù)拈蠙煊?、紅花籽油、大豆油和葵花油有利于灰樹花 (Grifola frondosa)菌絲體的增加，但是添加紅花籽油和葵花油卻不利于ESP的增加。王艷萍等人[9]報(bào)道添加1%的大豆油和橄欖油能夠促進(jìn)灰樹花(G.frondosa)ESP的合成，而添加其他植物油和表面活性劑吐溫80不能促進(jìn)灰樹花ESP的產(chǎn)生。郝利民等人報(bào)道油酸對(duì)裂褶菌 (Schizophyllum commune)ESP的產(chǎn)生有顯著促進(jìn)作用[29]。

2.7 真菌激發(fā)子

真菌激發(fā)子是能刺激真菌細(xì)胞產(chǎn)生和積累生物活性成分的一類物質(zhì)，包括多糖類、糖蛋白類、脂類等。在不同生長(zhǎng)階段用激發(fā)子處理，其細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累程度不同[31]。激發(fā)子濃度與產(chǎn)物積累的關(guān)系可以概括為兩種類型：一種為飽和曲線型，過量濃度的激發(fā)子對(duì)產(chǎn)物合成不會(huì)產(chǎn)生負(fù)作用；另一類型是激發(fā)子濃度與細(xì)胞反應(yīng)及產(chǎn)物合成曲線存在著一個(gè)最適點(diǎn)[32]。高興喜等人報(bào)道真菌激發(fā)子對(duì)靈芝多糖、三萜類物質(zhì)積累的誘導(dǎo)作用基本屬于第二種類型，激發(fā)子能提高靈芝多糖的含量[33]。李祝等人報(bào)道真菌多糖激發(fā)子能提高蟲草素的含量[34]，Zhu等人報(bào)道從夏塊菌 (Tuber aestivum vittad)中分離出的蛋白、多糖、脂類能刺激靈芝ESP的積累，整個(gè)激發(fā)子的加入能使ESP有最大產(chǎn)量0.92 g·L-1，其中多糖、蛋白的添加能使靈芝ISP達(dá)到最大產(chǎn)量1.94 g·L-1[35]。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

真菌多糖是藥用真菌中發(fā)現(xiàn)較早的關(guān)鍵成分之一，液體深層發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖工藝是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。藥用真菌多糖的合成代謝非常復(fù)雜，發(fā)酵過程中的細(xì)微差別都會(huì)引起多糖合成量的變化。因此，多糖的代謝調(diào)控是獲得藥用真菌多糖高產(chǎn)的主要策略。代謝調(diào)控，可以分為發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化和控制、代謝工程或途徑工程手段[36]。目前，由于藥用真菌多糖的合成途徑尚不明確，發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化和控制是最主要的調(diào)控方式。培養(yǎng)基組分對(duì)藥用真菌多糖的影響，就是一種典型的發(fā)酵過程調(diào)控方式。

目前，培養(yǎng)基成分對(duì)藥用真菌多糖影響的相關(guān)研究很多，優(yōu)化培養(yǎng)基成分能提高多糖生物合成量已被諸多研究結(jié)果所驗(yàn)證。但是，藥用真菌多糖合成代謝的相關(guān)研究很少，培養(yǎng)基成分影響多糖生物合成量的內(nèi)在機(jī)制尚未明確，培養(yǎng)基成分究竟影響多糖的合成還是分泌也無(wú)從得知。此外，國(guó)內(nèi)外大量研究數(shù)據(jù)顯示藥用真菌菌絲體的生長(zhǎng)與多糖的產(chǎn)量相關(guān)聯(lián)，但究竟有何關(guān)聯(lián)到目前為止還沒有定論。因此，藥用真菌多糖的生物合成代謝途徑及其調(diào)控是今后科研工作者努力的主要方向。

從基因水平、蛋白質(zhì)水平上闡明多糖的合成途徑，克隆與多糖合成相關(guān)的酶基因，以真菌多糖合成途徑的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)為切入點(diǎn)，局部設(shè)計(jì)、改造以及更新固有的代謝途徑，提高多糖產(chǎn)量，這將是今后研究的重要方向。此外，利用各種誘變手段對(duì)藥用真菌菌株進(jìn)行誘變，篩選生長(zhǎng)速度較快且多糖產(chǎn)量高的菌株，克服菌株退化，將可能成為提高多糖生物合成量的另一個(gè)重要研究方向。

總之，藥用真菌多糖的研究已得到國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究者的普遍關(guān)注。隨著糖化學(xué)分離、純化、合成和分子生物學(xué)、生物物理學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的不斷深入以及多糖制藥工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，藥用真菌多糖將成為具有探索、發(fā)掘新藥制劑和保健產(chǎn)品潛力的重要領(lǐng)域之一[2]，也將為開發(fā)綠色天然抗癌新藥與新型免疫體提供新的選擇。培養(yǎng)基組分對(duì)藥用真菌多糖的影響，作為提高藥用真菌多糖生物合成量的研究，無(wú)論在理論還是實(shí)踐指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)方面都具有重要的研究意義。

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