亞麻外源DNA導入的技術與實踐

康慶華

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，哈爾濱 150086)

1 外源DNA導入的理論

外源DNA導入在我國已有近30多年研究歷史，自20世紀70年代，我國學者周光宇女士首先提出植物遠緣雜交存在著DNA片段雜交的假說［1－2］以來，開展了棉花授粉后通過花粉管道導入外源DNA試驗，將海島棉DNA導入陸地棉引起了性狀變異，獲得了抗枯萎病的轉基因植株，經(jīng)過同位素標記驗證了在棉花授粉后24小時將3H－DNA注入棉花子房，4小時后切片經(jīng)3H－DNA放射自顯影清楚看到花粉管通道充滿了標記DNA，外源DNA從珠孔進入珠心達到胚囊。并用分子雜交驗證了基因的轉移及遺傳［3］。

利用開花植物授粉以后形成的花粉管通道，直接導入外源DNA來轉化尚不具有正常細胞壁的合子、卵或早期胚細胞，進而實現(xiàn)某些目的基因的轉移技術［4］。其理論基礎是作物受精過程中，精核的染色質在卵核內(nèi)分散的時間長達幾小時至十幾小時，而融合后的合子還要經(jīng)過10～20小時的靜止期［5－7］，這時不具備正常的細胞壁，有利于外源DNA的進入，從而實現(xiàn)某些目的基因的轉移。任何生物的DNA均由4種基本核苷酸連接而成，有可能在順序上出現(xiàn)程度不同的相同的排列有利于整合。DNA結構復雜，包括結構基因、調(diào)控基因，重復序列DNA。外源DNA片段進入受體，整合是隨機的，可能整合到結構基因中，也可能通過調(diào)控基因，以調(diào)控方式發(fā)揮作用。

20世紀90年代這一技術在國內(nèi)得到了廣泛的應用并取得了巨大成就。在棉花、水稻、小麥、蕃茄、玉米、花生、大豆、大麥、黃瓜等作物上都獲得了變異后代。

段曉嵐等將大米草DNA導入水稻，使其蛋白質含量提高了3．75%［8］。賴來展等將黑糯品種DNA導入白米品種，育成了高產(chǎn)、高蛋白的黑米新品系－黑優(yōu)粘96［9］，閻新甫等將抗白粉病二棱大麥DNA通過花粉管通道法直接導入感病小麥品種花76，獲得5個穩(wěn)定的抗白粉病株系［10］。雷勃鈞等利用該技術育成了早熟、高蛋白大豆新品種黑生101。岳紹先等將龍葵抗阿特拉津的基因導入大豆［11］，育成了抗阿特拉津的大豆新品種，并于1998年獲得農(nóng)業(yè)部科技進步三等獎。祈永紅等將紫玉米DNA導入玉米自交系抗甸11，獲得了具有供體性狀的優(yōu)良自交系［12］。

綜上所述，采用外源DNA導入技術不僅可以在品種間進行性狀的轉移［13］，而且還可以在不同的種、屬、科間進行性狀的轉移［14－16］，為近緣或遠緣野生資源的利用開辟了新途徑。該項技術不僅可以改良作物的品質及抗逆性，而且可以改變株高、粒重、粒色、葉色等各種性狀［17］達到雜交育種難以實現(xiàn)的效果，同時對提高抗病、抗蟲、抗除草劑能力，提高產(chǎn)量都有重要作用。

利用花粉管通道導入外源DNA技術，不僅在多種作物上獲得了豐富的變異材料，而且采用不同方法對該技術進行了檢驗。主要采用的方法有:植株性狀鑒定［17－18］、同工酶鑒定［19－20］、RAPD分子驗證［21］、Southern 雜交［22］等技術。

我所從亞麻的DNA的提取、亞麻的授粉時間、外源DNA導入的時間及方法、后代的變異及其鑒定等進行了研究，旨在提供一整套切實可行易于操作、效果顯著的亞麻外源DNA花粉管通道導入技術，對亞麻育種的理論與實踐起到一定的指導作用。

2 亞麻外源DNA導入技術

2.1 亞麻植株體DNA提取方法

DNA的提取和純化是為了獲得一定數(shù)量、一定純度的DNA，是DNA導入在植物育種上應用的第一步，只有提取到一定數(shù)量的合格的DNA才能進行DNA導入試驗。亞麻種子及植株都含有大量的果膠，果膠同DNA一樣在堿性條件下溶于水而不溶于乙醇。利用多數(shù)作物采用的氯仿－異戊醇－核糖核酸酶法提取亞麻根尖的DNA效果不十分理想，特別是利用亞麻植株提取DNA時效果更差，但由于亞麻種子小，尤其是野生亞麻發(fā)芽十分困難，必須利用植株體提取DNA。為此進行了亞麻植株DNA提取技術研究。對飽和酚法、氯仿－異戊醇－核糖核酸酶法、CTAB法、蔗糖研磨緩沖液提取法、改良高鹽－低pH法進行了研究。結果改良高鹽－低pH法為亞麻大量DNA提取的最適宜方法。

即在亞麻快速生長期，取植株體上部10～15cm的幼嫩部分，用自來水沖洗2～3次，再用蒸餾水沖洗2次后剪成1cm的碎段，取樣20克，在液氮冷凍條件下研磨成粉沫，加入等體積或4倍體積的提取緩沖液，65℃恒溫條件下，保持30～40分鐘，不斷振蕩，離心取上相，加入1/3～2/3體積的5M的醋酸鉀，0℃保持30分鐘，離心取上相加入0．6體積的冷異丙醇混勻后冷凍20分鐘離心，收集沉淀溶于0．1×SSC中。利用瓊脂糖凝膠電泳法對提取的DNA進行了檢測，供試樣品的DNA片段長度接近50kb，其長度符合分子育種外源DNA導入的要求，同時該方法具有高效、省時、無毒、簡便、經(jīng)濟等特點。是目前進行亞麻植株體DNA提取的比較理想的方法［23］。

2.2 亞麻授粉時間及授粉后子房內(nèi)部結構

由于不同作物的花器構造，大小及開花授粉時間不同，利用花粉管通道導入技術進行外源DNA導入的時間及方法也就不同。亞麻從授粉到受精需2．5～3小時［24］，受精后經(jīng)過24～30小時卵細胞開始分裂［24－25］，如此長時間的合子靜止期足以等待外源DNA的到達，所以問題的關鍵是在子房內(nèi)部是否有可供DNA進入的通道，于是進行了授粉后子房內(nèi)部結構的觀察。

利用不同時間現(xiàn)蕾的亞麻花朵去雄套袋的方法進行了亞麻自花授粉時間的觀察看出:8:00時的子房內(nèi)部未發(fā)現(xiàn)有明顯的通道，10:00的可見到花粉通道已達到子房的底部，從12時以后通道逐漸變大，14時以后從子房頂部到基部可見到明顯的通道，這給外源DNA的進入創(chuàng)造了方便的條件。

2.3 外源DNA導入的時間及方法

外源DNA導入有許多方法，具體作物應根據(jù)其花器結構、大小、形狀的不同而有所區(qū)別，同時應考慮到授粉、受精時間的影響及DNA導入時的溫、濕度變化。

亞麻的子房較大，每個蒴果具有5個子房室10個胚囊。子房上位并且包在萼片內(nèi)，花柱切割以后，滴DNA十分方便，因此選擇了花粉管通道法。具體的處理方法是:1、花柱中部切割滴注法;2、花柱基部切割滴注法;3、子房注射法。結果是，花柱基部切割滴注法成果率為81．8%，花柱中部切割滴注法成果率為92．1%，子房注射法成果率為53．8%。前兩種方法成果率均較高，但花柱基部切割縮短了切口到胚囊的距離，更有利于外源DNA通過花粉管通道進入胚囊。

根據(jù)外源DNA導入方法的試驗結果，采用花柱基部切割滴注法進行了亞麻外源DNA導入時間的研究。對外源DNA導入后代的篩選，可以獲得理想的變異材料。但有效的導入方法及適宜的導入時期對獲得更多的變異具有重要的作用。因為亞麻授粉時間在5點40分才能少量授粉，而授粉到受精還需要3h左右。8點30分可能還未達到授精階段，所以不能成活;10點30分至13點30分，成果率在50%～70%之間;16點30分以后的成果率在80%以上?？梢姡瑏喡橥庠磳氲某晒试?點鐘以后隨著時間的推移而逐步提高［26］。

2.4 外源DNA導入后代植株性狀的變化

對外源DNA導入后代各世代的觀察，發(fā)現(xiàn)其后代中具有廣泛的變異。花色、株高、種皮顏色、抗倒伏性等發(fā)生了明顯的變化。這四種變異為變異頻率較少，而變異極為顯著的性狀。還有些性狀需經(jīng)室內(nèi)考種或測試才能觀察到的變化，而且這些性狀是與育種目標極為相關的性狀。1995年利用D94001、D94002等6個DNA導入后代，對D1代的株高、工藝長度、麻率的變化進行了研究，株高和工藝長度與受體相比均有不同程度的降低，株高降低的幅度在6．1～20．1cm之間，工藝長度降低的幅度在2．3～25．2cm之間，D94001、D94002和D94006的株高和工藝長度與各自的受體有明顯的差異，麻率也有明顯的變化。DNA導入后代不僅可以發(fā)生變異而且可以穩(wěn)定遺傳。性狀表現(xiàn)看出:11點30分DNA導入的后代有明顯的變化，可以認為11點30分左右是DNA導入的適宜時間，尤以花柱基部切割法滴注效果最佳。

亞麻外源DNA導入后代同樣在多個性狀上發(fā)生了變異，花色、粒色、株高、工藝長度、麻率、抗倒伏等性狀都有變異，而且株高、工藝長度、麻率、抗倒伏等性狀的變異均趨向于供體。而麻率及抗倒伏性的提高正是目前亞麻育種所要解決的關鍵問題，這也說明外源總DNA導入對于育種中的實際問題的解決具有重要意義。

通過形態(tài)學觀察，遺傳學分析，發(fā)現(xiàn)亞麻外源DNA導入后代在株高、工藝長度、麻率、抗倒伏性、花色、種皮色等性狀有變異，一般D3～D4代可穩(wěn)定遺傳，利用該技術進行育種，可縮短育種年限，加速育種進程［27］。

2.5 外源DNA導入后代不同世代的遺傳力分析

遺傳力是指遺傳引起的變異量占變異總量的百分比，并非遺傳傳遞力［28］，但通過遺傳力的研究，確實能有效的預測后代的表現(xiàn)，因此對外源DNA導入后代的遺傳力進行了研究。結果是不同性狀各世代的遺傳力差異不大，但隨著世代的增加其遺傳力有增大的趨勢，各性狀均趨于穩(wěn)定遺傳。株高對亞麻原莖產(chǎn)量的直接影響效應最大［29］，遺傳力的大小可作為依表型株選時確定選擇寬度的指標［30］。從遺傳力分析結果可見，株高、工藝長度、出麻率均具有較高的遺傳力，所以對DNA導入后代在早世代對株高、工藝長度、麻率等性狀進行嚴格選擇，對于提高亞麻的原莖及纖維產(chǎn)量具有重要的意義。通過過氧化物酶同工酶酶譜分析，DNA導入后代與其受體的酶譜差異明顯，主要表現(xiàn)為酶譜帶數(shù)的不同和譜帶染色深淺的差異。由此表明外源DNA片段(或基因)已整合到受體基因組中，并得到表達［31］。

3 外源DNA導入實踐

亞麻外源DNA導入技術已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟的育種技術。采用該技術育成了一批亞麻優(yōu)良品種及品系。1993年以高纖、抗倒、早熟的法國亞麻品種FANY為供體，以高產(chǎn)品種黑亞l0號為受體進行DNA導入，組合號為D93007。按照育種目標進行了定向培育選擇，于l997年D4代篩選出了亞麻新品系D93007－15－8。

1998～2000年在所內(nèi)進行了鑒定試驗，經(jīng)過三年鑒定，該品系表現(xiàn)出了優(yōu)質、高產(chǎn)、抗倒伏的特性。于2001年參加全省區(qū)域試驗(編號為2001－1)。2002年同時進行了區(qū)域試驗及生產(chǎn)試驗。2003年3月經(jīng)黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會審查通過同意注冊，命名為黑亞14號［32］。黑亞l4號綜合了親本品種的優(yōu)異遺傳基因，具有高產(chǎn)、優(yōu)質、抗倒伏、抗病等優(yōu)點，2003～2005年在黑龍江省累計推廣面積達到1O余萬hm2，增產(chǎn)亞麻原莖7萬t。增加經(jīng)濟效益2．1億元。黑亞l4號不僅適宜于黑龍江省廣大地區(qū)種植，還推廣到吉林、內(nèi)蒙、新疆、云南等十幾個省(區(qū))，示范效果顯著［33］。

2006年育成的黑亞16號是以高纖、抗病、抗倒、早熟的俄羅斯亞麻品種俄－5為供體，以我所育成的優(yōu)質、高纖、抗旱品種黑亞4號為受體進行DNA導入，于2000年D4代決選出了亞麻新品系D96021－1。經(jīng)兩年鑒定試驗和兩年區(qū)域試驗均表現(xiàn)出高纖、優(yōu)質、抗病、抗倒等優(yōu)點。2005年生產(chǎn)試驗原莖產(chǎn)量5842．3kg/hm2，比對照增產(chǎn) 11．8%;長麻產(chǎn)量986．6kg/hm2，比對照增產(chǎn) 18．1%;全麻1469．7kg/hm2，比對照增產(chǎn) 18．6% 種子產(chǎn)量 405．9kg/hm2，比對照增產(chǎn) 15．8%;長麻率 20．6%，比對照高0．9 個百分點;全麻率30．8%，比對照高1．3 個百分點［34］。

2007年育成的黑亞17號是以法國品種Ariane為供體、品系81－8－6－3為受體的導入后代選育而成的纖維亞麻新品種。原莖、長麻，全麻、種子產(chǎn)量分別達到5595．9、873．1，l338．7和594．7 kg/hm2。分別比對照增產(chǎn) 9．O%、16．5%、11．7%和 16．2%。長麻率 19．5%，比對照高 1．7 個百分點;全麻率29．9%，比對照高1．1個百分點。2007年于3月通過黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會登記推廣［35］。

此外，目前還育成了一些品系，如D2000004－7－6、D2000004－30－3、D97009－2等，原莖、長麻，全麻、種子產(chǎn)量都比對照(黑亞11號)增產(chǎn)10%以上，長麻率比對照高1．5個百分點以上;全麻率都在30．0%以上。目前，這些品系還有待進一步鑒定推廣應用。

由此可見，應用亞麻外源DNA導入技術選育亞麻新品種是繼系統(tǒng)選育、雜交育種、誘變育種之后又一育種新途徑。它具有速度快、效果好等突出優(yōu)點，豐富了亞麻育種的理論與技術，對我國的亞麻育種、生產(chǎn)、教學等都具有重要意義。

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