晚期非小細(xì)胞肺癌患者體液標(biāo)本表皮生長(zhǎng)因子受體突變基因檢測(cè)的進(jìn)展

王 灃 操樂(lè)杰

盡管肺癌的診斷、分期、治療日趨規(guī)范化，但由于缺乏有效的早期篩查制度和方法，加之傳統(tǒng)化療的療效出現(xiàn)平臺(tái)期，導(dǎo)致肺癌患者總體預(yù)后依然很差，5年生存率僅為16%［1］。隨著分子腫瘤學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，其突變參與了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲等過(guò)程。針對(duì)這一靶點(diǎn)的藥物酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、?？颂婺岬?開(kāi)創(chuàng)了肺癌分子靶向治療的先河。臨床實(shí)踐證明非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者間存在分子靶向藥物療效上的差異，這種差異主要體現(xiàn)在肺癌患者體細(xì)胞EGFR是否存在分子突變。而發(fā)生分子突變的患者療效極佳，可見(jiàn)突變檢測(cè)對(duì)選擇合適人群進(jìn)行靶向治療具有重大意義。過(guò)去對(duì)EGFR突變檢測(cè)多是基于組織標(biāo)本，但晚期肺癌患者組織標(biāo)本往往很難獲得，因此找到一種理想的標(biāo)本，建立合適的檢測(cè)方法進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)就NSCLC患者極易反復(fù)獲取的體液標(biāo)本中的EGFR基因突變檢測(cè)及意義加以綜述。

一、EGFR的常用檢測(cè)方法

直接測(cè)序法被公認(rèn)為是EGFR基因檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該法能確切判斷突變堿基及突變位置，而且可以發(fā)現(xiàn)新的突變基因。但被測(cè)標(biāo)本DNA純度要求不能低于30%突變才能檢出，因而，往往需要選用微切割腫瘤組織標(biāo)本［2］。為了滿足臨床的廣泛需求，國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用不同EGFR檢測(cè)方法對(duì)晚期NSCLC患者的體液標(biāo)本進(jìn)行過(guò)嘗試，目前報(bào)道較多的三種是蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變法(SARMS法)、突變體富集法PCR、變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC法)。

1．SARMS法:該方法引入了應(yīng)用于等位基因鑒定的Scorpions蝎形結(jié)構(gòu)特異性探針。該探針包含一個(gè)與3'，端共價(jià)相連的PCR引物，僅僅能識(shí)別突變序列，而不識(shí)別正常序列，附加錯(cuò)配突變?cè)O(shè)計(jì)在3'，端引物序列中，從而實(shí)現(xiàn)特異性的擴(kuò)增。Scorpions探針與ARMS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用比常見(jiàn)的熒光探針PCR技術(shù)更為先進(jìn)，其可檢測(cè)單個(gè)突變，提高了方法的特異性及檢測(cè)結(jié)果的可靠性。國(guó)內(nèi)廈門艾德公司在基于實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)的基礎(chǔ)上結(jié)合了特異引物和雙環(huán)探針兩種技術(shù)，建立了ADx特異擴(kuò)增技術(shù)。該試劑盒與國(guó)際公認(rèn)EGFR檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)結(jié)果的一致性上已經(jīng)被國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院所驗(yàn)證，有望使SARMS法對(duì)EGFR突變的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加快捷，費(fèi)用更經(jīng)濟(jì)。但SARMS法也有局限，它是針對(duì)已知突變基因進(jìn)行相應(yīng)探針的設(shè)計(jì)，因此無(wú)法檢測(cè)未知突變基因。

2．突變體富集PCR法:該方法基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化野生型的EGFR基因片斷，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的富集，再使用PCR放大和凝膠電泳技術(shù)，根據(jù)產(chǎn)物的大小進(jìn)行突變的判斷。該方法同樣是基于PCR技術(shù)，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免污染尤其重要，目前該方法主要用于19、21外顯子的基因突變檢測(cè)，不能檢測(cè)約占全部突變10%左右的其他EGFR基因的突變。

3．DHPLC法:變性高效液相色譜技術(shù)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外興起的一種用于分析核苷酸片段的技術(shù)平臺(tái)。該系統(tǒng)可在非變性、部分變性、完全變性三種條件下運(yùn)行，其中部分變性條件適用于EGFR基因突變的檢測(cè)，能分離、識(shí)別野生型及突變型DNA雙鏈。DHPLC法在EGFR突變基因檢測(cè)峰型中易于判讀，且有利于發(fā)現(xiàn)未知突變基因，具有快速、高通量、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，該方法不足的是只能檢測(cè)有無(wú)突變，而不能區(qū)分突變類型。

二、不同標(biāo)本中EGFR突變基因檢測(cè)在臨床的應(yīng)用

1．外周血標(biāo)本中EGFR突變基因的檢測(cè)

早在1977年，Leon等［3］已發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清、血漿中循環(huán)DNA含量明顯高于健康人群。其來(lái)源可能與原發(fā)腫瘤的釋放、外周循環(huán)中腫瘤微轉(zhuǎn)移灶的釋放、腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死釋放有關(guān)［4］。采用PCR探針技術(shù)和熒光技術(shù)，對(duì)肺癌患者外周血標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變基因檢測(cè)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)盡可能的將血和腫瘤組織進(jìn)行匹配或者對(duì)同一類型標(biāo)本采用不同方法檢測(cè)，并通過(guò)觀察分子靶向治療效果以驗(yàn)證循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)及外周血游離DNA(cell free DNA，cfDNA)中EGFR突變基因檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

(1)外周血游離DNA(cfDNA):指外周血細(xì)胞外DNA，存在于血清、血漿中的游離DNA都可用來(lái)檢測(cè)EGFR突變基因。二者的優(yōu)劣性采用血漿似乎要比血清更好，這可能與血清中的混合成分有關(guān)，有研究稱隨著炎性細(xì)胞數(shù)量的增加，血清循環(huán)DNA比例增加，而血漿并非如此［5］。血標(biāo)本具有獲取方便的優(yōu)點(diǎn)，但容易被污染。相關(guān)研究表明cfDNA被污染量與標(biāo)本采集后血清、血漿分離時(shí)間成正相關(guān)［6］。此外cfDNA穩(wěn)定性較差，血清、血漿cfDNA標(biāo)本在處理前應(yīng)保存于－20℃或是更低的環(huán)境，且濃度波動(dòng)范圍很大(10～1200 ng/ml)，片段短(－180 bp)，由腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死產(chǎn)生的cfDNA在總cfDNA中的比例不等(3% ～93%)，不同腫瘤類型cfDNA的比例亦不一致，并且與腫瘤的分期、分級(jí)、大小及位置有關(guān)。鑒于以上特點(diǎn)，cfDNA用于基因檢測(cè)對(duì)方法的選擇要求很高，直接測(cè)序法存在著很大的局限性。Kimura等［7］研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在血標(biāo)本中敏感度僅為66%，特異度為71%，這可能會(huì)導(dǎo)致部分EGFR突變陽(yáng)性的患者因?yàn)闄z測(cè)方法選擇不當(dāng)而失去谷氨酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑治療的機(jī)會(huì)。較敏感檢測(cè)方法SARMS法在cfDNA的應(yīng)用報(bào)道較多，2007年Kimura報(bào)道采用SARMS法檢測(cè)cfDNA樣本中EGFR的敏感性為85%，特異性94%，腫瘤組織和血標(biāo)本突變檢測(cè)結(jié)果一致率高達(dá)92．9%［8］。在用血清標(biāo)本中檢測(cè)EGFR陽(yáng)性的患者給予吉非替尼治療獲得的中位 PFS明顯長(zhǎng)于 EGFR陰性的患者(174 d vs 58 d，P=0．044)。在此之后Maheswaran報(bào)道12例肺癌患者游離血漿標(biāo)本中有4例EGFR陽(yáng)性［9］。Liu等［10］對(duì)18例血漿標(biāo)本中用SARMS法突變檢出率為80%。以上研究所示的突變檢出率波動(dòng)幅度很大，其原因可能與入組的條件等有關(guān)，其中腫瘤的分期也影響著EGFR突變檢測(cè)結(jié)果。Bai等［11］對(duì)230例ⅢB期-Ⅳ期NSCLC腫瘤組織和cfDNA標(biāo)本使用DHPLC法進(jìn)行了19、21號(hào)外顯子EGFR突變分析，結(jié)果顯示cfDNA和相匹配的腫瘤組織突變一致性達(dá)79．7%。此外Yung等［12］對(duì)微數(shù)字PCR方法進(jìn)行過(guò)嘗試，該法能檢測(cè)單個(gè)突變DNA分子，并可精確地區(qū)別突變和野生型序列，對(duì)血漿標(biāo)本中EGFR突變檢測(cè)的敏感性和特異性能達(dá)到92%和100%，較SARMS法更適合EGFR突變檢測(cè)。

目前突變體富集PCR法應(yīng)用較廣泛?；莞：５龋?3］應(yīng)用突變體富集PCR法檢測(cè)EGFR基因21號(hào)染色體突變情況，在23例腫瘤組織中有8例突變陽(yáng)性，其中采用cfDNA檢測(cè)中7例得到一致結(jié)果(87．5%)。突變體富集PCR法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物的富集，He等［14］在此基礎(chǔ)上聯(lián)合采用直接測(cè)序法，在血漿cfDNA中發(fā)現(xiàn)19、21外顯子EGFR突變檢出率達(dá)49．3%，與配對(duì)的腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果一致性為94．4%。cfDNA中EGFR突變陽(yáng)性較野生型患者在應(yīng)用吉非替尼二線治療后PFS有很大差異(7．609個(gè)月vs 2．877個(gè)月，P=0．002)。Jiang等［15］證實(shí)對(duì)cfDNA采用突變體富集PCR檢測(cè)EGFR突變結(jié)果和組織標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)果的一致性可達(dá)93．1%，且cfDNA中突變體富集法的敏感性和特異性分別為77．8% 和100%，相反非富集PCR技術(shù)的敏感性和特異性則要遜色很多。

(2)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC):外周血成份復(fù)雜，為了降低檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性，產(chǎn)品的純化十分必要。通常每毫升血中CTC數(shù)量?jī)H為1～10個(gè)，這較混合存在的白細(xì)胞及紅細(xì)胞數(shù)量少很多，導(dǎo)致檢測(cè)難度較大。相對(duì)較成熟的CTC濃縮檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種較好的方法。

CTC檢測(cè)在乳腺癌、結(jié)腸癌等癌癥患者中涉及頗廣。Maheswaran等［9］基于微流體技術(shù)設(shè)計(jì)了一個(gè)分離、純化芯片，針對(duì)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的抗體，分離出NSCLC患者CTC，并對(duì)分離后的CTC采用SARMS法進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達(dá)92%。CTC標(biāo)本在EGFR突變檢出靈敏度方面較cfDNA標(biāo)本高，但其腫瘤細(xì)胞的純化技術(shù)復(fù)雜，目前難以推廣，其優(yōu)越性有待進(jìn)一步證實(shí)。

采用NSCLC患者外周血標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)具有可行性，cfDNA標(biāo)本較CTC標(biāo)本在目前的應(yīng)用更為廣泛。血標(biāo)本EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)臨床治療很有價(jià)值。鑒于標(biāo)本自身的特點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)方法而言敏感性較高的SARMS法及突變體富集PCR法更受青睞，尤其是采用試劑盒的SARMS法在操作上更有明顯優(yōu)越性。

2．胸腔積液標(biāo)本中EGFR突變基因的檢測(cè)

惡性胸腔積液在各類型肺癌中很常見(jiàn)，尤其在肺腺癌中更為多見(jiàn)，其形成往往與腫瘤的直接侵犯或是胸膜轉(zhuǎn)移有關(guān)，合并積液的患者往往提示腫瘤晚期不能接受外科手術(shù)［16］。研究發(fā)現(xiàn)胸腔積液脫落細(xì)胞是檢測(cè)致癌基因點(diǎn)突變很有價(jià)值的標(biāo)本，很多學(xué)者對(duì)此類標(biāo)本用作EGFR基因突變檢測(cè)進(jìn)行了探討。

(1)胸腔積液DNA片段游離細(xì)胞(cell-free pleural fluid):惡性胸腔積液中往往存在著片段DNA，但其濃度很低，Kimura等［17］收集了43例ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者的胸腔積液游離細(xì)胞標(biāo)本，應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)EGFR18-21號(hào)外顯子進(jìn)行了突變分析，突變檢出率為25．6%，其中女性、非吸煙人群檢出率較高。該組中的27例患者給予吉非替尼靶向治療后病灶達(dá)到PR、SD的各有7例，檢測(cè)結(jié)果均為突變陽(yáng)性。而突變陰性的患者均為疾病持續(xù)進(jìn)展者。Wu等［18］采用直接測(cè)序法在該類標(biāo)本中的突變檢出率達(dá)高68．4%，這一差異可能是所檢測(cè)的范圍和入組的條件不同所致。

何臣等［19］對(duì)30例NSCLC患者胸腔積液游離DNA進(jìn)行了EGFR19及21外顯子突變分析，并比較了酶切富集PCR法及非酶切富集PCR法對(duì)胸腔積液EGFR基因突變檢出率的差異。結(jié)果證實(shí)酶切富集PCR法的檢測(cè)靈敏性顯著高于非酶切富集PCR法(50．0%vs 23．3%)，這一結(jié)果與Zhang等［20］報(bào)道的檢出率相當(dāng)(50．0%vs 31．0%)。酶切富集PCR法對(duì)胸腔積液DNA游離細(xì)胞標(biāo)本EGFR突變基因檢測(cè)是一種較直接測(cè)序法更為靈敏、簡(jiǎn)便可行、能解決問(wèn)題且費(fèi)用低廉的方法，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

(2)胸腔積液細(xì)胞(pleural effusion cells):由于肺癌胸腔積液標(biāo)本包含有突變成分、正常細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及間皮細(xì)胞等混合成分，導(dǎo)致DNA純度不夠，入組的患者檢出突變率多較低。Kimura等［21］收集了24例NSCLC患者的胸腔積液，采用胸腔積液細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用直接測(cè)序法和敏感性較高的SARMS法對(duì)EGFR18-21號(hào)外顯子突變基因進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)出8例突變陽(yáng)性患者，其中有3例在兩種方法中出現(xiàn)一致的結(jié)果，而另外5例僅在敏感性高的SARMS法檢測(cè)中出現(xiàn)陽(yáng)性突變。值得關(guān)注的是在入組的患者中有7例得到吉非替尼治療，其中4例達(dá)到PR，直接測(cè)序法檢測(cè)到陽(yáng)性的患者只有2例達(dá)到PR。在此研究中直接測(cè)序法突變檢出率僅為12．5%，而SARMS法突變檢出率為33．3%。這預(yù)示惡性胸腔液是一種可選的被檢測(cè)標(biāo)本類型，SARMS法靈敏度明顯高于直接測(cè)序法。值得注意的是Zhang等［20］對(duì)胸腔積液無(wú)細(xì)胞懸液和脫落細(xì)胞沉渣兩種標(biāo)本EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二者在敏感性高的突變體富集PCR方法中檢測(cè)結(jié)果具有一致性。

在異質(zhì)性高的胸腔積液標(biāo)本中，敏感性較高的SARMS法和突變體富集PCR法檢測(cè)擁有較大的優(yōu)勢(shì)。胸腔積液標(biāo)本的留取、儲(chǔ)藏較為簡(jiǎn)便，和石蠟組織標(biāo)本比較更為新鮮，而且該類標(biāo)本EGFR陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果有指導(dǎo)臨床靶向治療的價(jià)值。

3．其他:支氣管鏡檢查、痰液檢查是臨床診斷肺癌的重要手段，但面臨的困難依然是不能獲得足夠的組織以滿足病理評(píng)估后的基因分析。Hiroyuki等［22］收集了61例肺癌患者的支氣管內(nèi)膜上皮細(xì)胞襯液標(biāo)本，應(yīng)用PNA-LNA鉗夾法進(jìn)行了EGFR突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)敏感率達(dá)58．3%。該方法簡(jiǎn)單、安全，且未直接接觸瘤體，在進(jìn)行活檢、灌洗、刷片前只需用一微量樣本采集探針進(jìn)行上皮細(xì)胞襯液采集即可，避免了血液雜合成分的影響。表明氣管鏡采集微量標(biāo)本是另外一種檢測(cè)腫瘤基因改變的補(bǔ)充方法。痰液標(biāo)本含有呼吸道上皮脫落細(xì)胞，是容易獲得的生物學(xué)標(biāo)本。痰細(xì)胞學(xué)已用于肺癌的診斷分析，但腫瘤相關(guān)細(xì)胞DNA或游離DNA量相對(duì)于炎性細(xì)胞DNA的量較少，因而目前尚未見(jiàn)到以該類標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)。

對(duì)NSCLC患者接受TKI治療前進(jìn)行EGFR基因突變基因的篩選，無(wú)論采用哪種標(biāo)本類型，應(yīng)保證足夠多的腫瘤細(xì)胞，盡量剔除非腫瘤細(xì)胞。突變檢測(cè)的方法及細(xì)胞純化的技術(shù)尚有待進(jìn)一步改進(jìn)，體液標(biāo)本與組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的一致性及體液標(biāo)本突變陽(yáng)性患者靶向獲益的情況報(bào)道不一，尚需更多的研究進(jìn)一步證實(shí)。對(duì)于不能獲得組織標(biāo)本的NSCLC患者應(yīng)用外周血、胸腔積液等體液標(biāo)本進(jìn)行EGFR突變基因檢測(cè)將為患者TKI治療提供有價(jià)值的依據(jù)。

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