代謝型谷氨酸受體5在大鼠顳下頜關(guān)節(jié)疼痛中的作用

李波，盧利，譚學(xué)新，劉純義，易新，劉焱

（中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 1.口腔解剖生理教研室；2.口腔頜面外科，沈陽 110002）

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。╰emporomandibular joint disorders，TMD）是一種常見病和多發(fā)病，涉及顳下頜關(guān)節(jié)和咀嚼肌系統(tǒng)，是具有相關(guān)臨床問題的一組疾病的總稱［1］。以關(guān)節(jié)疼痛、彈響和開口受限為主要臨床癥狀，其中疼痛是多數(shù)TMD患者就診的主要原因，但關(guān)于疼痛的病理生理機(jī)制尚未清楚［2］。

Ⅰ型代謝型谷氨酸受體5（metabtrophic glutamate receptor subtype 5，mGluR5）是谷氨酸受體的一種，近年研究表明其參與多種疼痛過程［3～6］。MPEP是一種特異性的mGluR5拮抗劑，可以特異性抑制mGluR5激活，而對(duì)Ⅰ型代謝型谷氨酸受體的其他亞型無抑制作用［7］。有學(xué)者研究證實(shí)MPEP可以緩解外周神經(jīng)損傷造成的神經(jīng)病理性疼痛［8，9］。本研究擬通過建立甲醛誘導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)疼痛模型，觀察大鼠傷害性反應(yīng)行為變化，探討mGluR5在甲醛誘導(dǎo)的炎性疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器與試劑

成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物使用符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)及要求。儀器包括：精密電子天平、普通電子天平（北京聯(lián)動(dòng)盈創(chuàng)科技發(fā)展公司）、721型可見分光光度儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；多聚甲醛和MPEP（美國Sigma公司）、戊巴比妥鈉（上海易利生生物制劑）、5%甲醛注射液（37%甲醛原液與生理鹽水混合配制而成）。

1.2 方法

1.2.1 分組：將大鼠編號(hào)，按照隨機(jī)分配表隨機(jī)分為6組，每組6只。分為：正常對(duì)照組（未作任何處理）、陰性對(duì)照組（生理鹽水注射）、甲醛組（5%甲醛注射）、MPEP-1組［5%甲醛注射+MPEP（1 mmoL/L）注射］、MPEP-2組［5%甲醛注射+MPEP（2.5 mmoL/L）注射］、MPEP-3組［5%甲醛注射+MPEP（5 mmoL/L）注射］。每籠6只大鼠，在室溫（23±1）℃環(huán)境內(nèi)，自由進(jìn)食，晝夜交替規(guī)律循環(huán)，飼養(yǎng)1周，然后置于30 cm×30 cm×30 cm一側(cè)透明木箱內(nèi)，玻璃對(duì)側(cè)置攝像頭記錄動(dòng)物的傷害性行為反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)在早8：30至晚5：00之間進(jìn)行。

1.2.2 顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射及大鼠傷害性行為觀測：乙醚吸入麻醉下（劑量以能夠完成顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射即可），觸摸顴弓后下方，在SD大鼠右側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)用微量注射器吸入50 μL注射液，循顴弓后方立即進(jìn)針，然后向前直至髁狀突后外側(cè)注射藥物，針于原位停留1 s防止藥物外滲。MPEP組分別于建模型前20 min注射1，2.5，5 mmoL/L MPEP 25 μL。藥物注射后30 s動(dòng)物立刻蘇醒，回到測試空間。觀察大鼠傷害性行為，包括退縮、搖頭及刮擦頭面部，記錄刮擦頭面部及縮頭反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。連續(xù)觀察60 min，每隔3 min計(jì)數(shù)動(dòng)物的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。所有測試均采用雙盲法，即1人注射，另外1人觀察動(dòng)物的行為學(xué)變化。

1.2.3 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)Evan′s藍(lán)結(jié)合血漿蛋白滲出量測定：動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下（40 mg/kg，ip）將 Evan′s藍(lán)染料（0.1%，5 mg/kg）注入右側(cè)股靜脈，10 min后，用肝素+生理鹽水灌注，切取關(guān)節(jié)組織，稱重，貯存在-20℃冰箱備用。關(guān)節(jié)組織在丙酮和5%硫酸鈉混合物（7∶3）室溫下孵育過夜。孵育后樣品以300 r/min離心10 min，用分光光度計(jì)在波長620 nm下分析染料存在的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甲醛誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)疼痛大鼠的傷害性行為反應(yīng)

結(jié)果可見，大鼠傷害性行為反應(yīng)持續(xù)時(shí)間在正常組為（78.5±11.6）s，生理鹽水組為（88.5 ±10.5）s，并未觀察到大鼠退縮及將頭轉(zhuǎn)向注射側(cè)，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在各實(shí)驗(yàn)組，動(dòng)物縮頭及轉(zhuǎn)頭持續(xù)時(shí)間明顯高于正常組及生理鹽水注射組。甲醛注射后，甲醛組大鼠表現(xiàn)為刮擦頭面部及縮頭反應(yīng)，60 min內(nèi)總的傷害性行為反應(yīng)持續(xù)時(shí)間達(dá)（472.3±34.2）s，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。預(yù)先注射MPEP后動(dòng)物的傷害性反應(yīng)減少，呈劑量依賴性，MPEP-1、MPEP-2、MPEP-3 組傷害性行為反應(yīng)持續(xù)時(shí)間分別為（462.4±14.3）s、（403.2±15.0）s、（184.1±27.0）s。與甲醛組比較，MPEP-1 組和MPEP-2組大鼠傷害性行為反應(yīng)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而MPEP-3組的傷害性行為反應(yīng)明顯低于甲醛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)血漿蛋白滲出量比較

結(jié)果可見，大鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)血漿滲出量正常對(duì)照組為（2.56±0.89）μg/g，生理鹽水組為（2.61±0.43）μg/g，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。注射甲醛后，甲醛組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)血漿滲出量明顯增加，為（20.32±2.12）μg/g，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。注射MPEP后大鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)血漿滲出量減少，MPEP-1組、MPEP-2組和 MPEP-3 組分別為（19.06±0.25）μg/g、（18.56±1.59）μg/g、（9.42±1.49）μg/g，與正常對(duì)照組比較，MPEP-1組、MPEP-2組和MPEP-3組血漿滲出量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MPEP-3組與模型組比較，血漿滲出量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

流行病學(xué)研究［10］表明，人群中5.3%存在顳下頜關(guān)節(jié)痛。TMD患者面部不適和疼痛反復(fù)發(fā)作，在頭痛個(gè)體中，有14%～26%為TMD導(dǎo)致的疼痛。TMD已經(jīng)成為慢性頭痛和面部痛的原因之一。甲醛作為傷害性刺激因子，可引起急性疼痛。已廣泛用于研究疼痛機(jī)制的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，可很好地模擬炎性痛［11］。本實(shí)驗(yàn)將甲醛注射液注入顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)，造成關(guān)節(jié)局部刺激痛。本研究成功建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)疼痛模型，從而能夠觀察到動(dòng)物明顯出現(xiàn)刮擦頭面部、縮頭等傷害性行為反應(yīng)。

甲醛致痛的典型特征是形成雙相痛［12］。前5 min為第一相，20～60 min為第二相。第一相注射開始即產(chǎn)生，持續(xù)時(shí)間短，認(rèn)為是由于甲醛注射本身刺激造成的，有時(shí)會(huì)由于動(dòng)物尚未蘇醒無法記錄。本實(shí)驗(yàn)前5 min并未監(jiān)測出明顯的傷害性行為反應(yīng)，認(rèn)為可能是麻醉掩蓋了第一相所致。因此本實(shí)驗(yàn)觀察第二相反應(yīng)變化。結(jié)果顯示，注射生理鹽水組與正常對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。注射甲醛后，大鼠傷害性行為反應(yīng)持續(xù)時(shí)間明顯高于正常對(duì)照組和生理鹽水組（P<0.05），與將甲醛注射液注入口唇部研究結(jié)果相似［14］。在正常組及生理鹽水注射組未觀察到大鼠退縮及將頭轉(zhuǎn)向注射側(cè)；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物縮頭及轉(zhuǎn)頭持續(xù)時(shí)間明顯高于正常組及生理鹽水注射組，這與臨床上看到的口頜面疼痛患者經(jīng)常將頭轉(zhuǎn)向患側(cè)相似。

機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)損傷部位出現(xiàn)局部血管擴(kuò)張、血流增多、水腫和滲出等現(xiàn)象。將Evan′s藍(lán)注入循環(huán)系統(tǒng)，使其與血漿蛋白結(jié)合，在炎癥部位Evan′s藍(lán)可隨血漿滲出到皮下。本研究結(jié)果顯示，注射甲醛后，甲醛組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)血漿滲出量明顯增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說明甲醛注射液注入顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)可造成關(guān)節(jié)局部刺激痛。與正常對(duì)照組比較，注射MPEP后大鼠顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)血漿滲出量減少（P<0.05）；而與甲醛組比較，各MPEP組血漿滲出量明顯降低（P<0.01）。認(rèn)為外周注射甲醛能導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)炎性滲出，并迅速引起外周谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，預(yù)先注射代謝型谷氨酸受體拮抗劑可以明顯減少Evan′s滲出量。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明甲醛誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)疼痛可以激活代謝型谷氨酸受體5，特異性應(yīng)用其抑制劑可以明顯減輕炎性痛。下一步要探討代謝型谷氨酸受體在甲醛誘導(dǎo)的顳下頜關(guān)節(jié)炎性痛中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明顳下頜關(guān)節(jié)疼痛機(jī)制提供依據(jù)。

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