淺談植物多倍體鑒定方法

張紅亮，姚先玲，李 霞，孫 晶

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，山西 太原 030006）

細(xì)胞染色體作為植物遺傳基因的主要載體，其倍數(shù)性的變化是導(dǎo)致植物產(chǎn)生較大遺傳變異，產(chǎn)生性狀變化的重要途徑。人為采取各種物理、化學(xué)、生物等方法可以促使植物細(xì)胞染色體成倍數(shù)性增加，從而改變植物遺傳性狀、提高抗逆性、提高產(chǎn)量和有效成分含量，這種方法稱為多倍體育種[1]。這是一種有效的育種方法，一方面可誘導(dǎo)多倍體作遺傳橋梁，把一些其它性狀好但育性差、無法進(jìn)一步進(jìn)行雜交利用的奇數(shù)倍植株經(jīng)過加倍后育性正常，為常規(guī)雜交育種提供抗源材料；另一方面，通過染色體加倍，可能得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲等優(yōu)良性狀的新品種，這些已在葡萄、柿等多種果樹的多倍體育種中得到驗(yàn)證[2]。近幾年，各國研究者對(duì)許多植物進(jìn)行了廣泛的多倍體研究，包括果樹、蔬菜、花卉、中藥材、草類等?，F(xiàn)將植物多倍體鑒定方法綜述如下：

1 染色體鑒定法

1.1 染色體制片法

染色體制片法是進(jìn)行細(xì)胞倍性鑒定最直接、最可靠的方法，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，而且不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器，是目前應(yīng)用最多的鑒定方法。用秋水仙素誘導(dǎo)GCTCV-119香蕉多倍體，經(jīng)根尖染色體數(shù)目檢測(cè)，在外部形態(tài)上沒變化的植株，其根尖染色體數(shù)目一般為 33（2n=3x=33）條，而在外部形態(tài)上表現(xiàn)為假莖、葉柄粗壯、葉片肥厚、變圓或皺縮扭曲的植株基本上都加倍了，但多數(shù)為嵌合體。加倍了的細(xì)胞染色體數(shù)目為66（2n=6x=66）[2]。

1.2 流式細(xì)胞儀鑒定

流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)現(xiàn)代化的DNA倍性分析的高新技術(shù)，通過對(duì)細(xì)胞的光散射和不同熒光的多參數(shù)同步測(cè)定，可對(duì)單細(xì)胞的倍性進(jìn)行快速精確的分析。該方法最突出的特點(diǎn)是測(cè)量快速，已被成功地用于玉米、向日葵、甘薯、獼猴桃、李、番茄、蘋果、草莓的倍性鑒別上。研究者對(duì)13個(gè)二倍體蘋果品種和5個(gè)三倍體蘋果品種核DNA含量測(cè)定結(jié)果表明，三倍體為二倍體的1.38倍[3]。

1.3 染色中心直徑和異染色質(zhì)數(shù)目鑒定法

韓毅科等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，不同倍性黃瓜染色中心的直徑和異染色質(zhì)的數(shù)目差異顯著，與植株倍性呈正相關(guān)。其中單倍體染色中心直徑平均為5.1 μm，雙單倍體為13.3 μm；單倍體異染色質(zhì)數(shù)目平均5.0，雙單倍體為11.9。

2 形態(tài)特征鑒定法

2.1 葉片形態(tài)

四倍體黃瓜的部分器官表現(xiàn)出“巨大性”，葉面積均比二倍體的大，差異顯著或極顯著。隨著染色體成倍增加，葉片逐漸變厚，葉緣逐漸變皺褶，葉色逐漸加深[5]。經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)后形成的桔梗多倍體植株與原二倍體植株比較，在形態(tài)上，多倍植株葉片變寬變大，葉色變深，莖變粗且節(jié)距長[6]。四倍體三色堇形態(tài)特征十分明顯，表現(xiàn)出葉色濃綠，葉片肥厚[7]。

2.2 葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目及葉片氣孔大小

對(duì)三倍體和六倍體香蕉葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，加倍后葉綠體數(shù)目明顯增加，大約為加倍前葉綠體數(shù)目的2倍[2]。通過FDA熒光法觀察，西瓜四倍體、三倍體、二倍體葉片保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目分別為 19.9±3.4、15.9±2.2、11.5±1.5，其比例約為 4∶3∶2，與西瓜的倍性一致[8]。葉片氣孔鑒定可作為多倍體鑒定的間接方法。試驗(yàn)表明，桔梗多倍體（即四倍體）氣孔增大而單位葉面積氣孔數(shù)目減少，氣孔明顯大于二倍體氣孔，鑒定結(jié)果較可靠[6]。

2.3 花特征鑒定法

單倍體、二倍體、四倍體黃瓜的雌花隨倍性的增加而變大；二倍體和四倍體的雄花逐漸變大，花瓣表面和邊緣逐漸變皺折，花色漸深；單倍體的雄花在開放前黃化敗育。四倍體雌花子房上的果刺比二倍體的粗密，而單倍體的則較細(xì)疏[5]。四倍體三色堇花朵巨大、花瓣厚而挺、香味濃、花色艷麗、花斑大、氣孔和花粉粒巨大，使得四倍體三色堇的觀賞價(jià)值大為提高[7]。

3 條件鑒定法

包括高溫脅迫法和低溫脅迫法，其原理是利用植物在不同的實(shí)驗(yàn)條件下生理狀態(tài)不同進(jìn)行倍性鑒定。郭啟高等[9]在西瓜子葉離體組織培養(yǎng)中利用西瓜二倍體和四倍體對(duì)高溫和低溫的不同反應(yīng)進(jìn)行倍性鑒定。他們確定，50℃持續(xù)10 h為高溫脅迫的臨界點(diǎn)，0℃持續(xù)5 h為低溫脅迫的臨界點(diǎn)，通過此方法鑒定的倍性符合度為90%和80%。

4 同工酶鑒定法

同工酶作為植物界存在的一種普遍現(xiàn)象受到了廣泛的研究，并且應(yīng)用于植物遺傳育種等方面，一般隨染色體倍性的增加同工酶活性降低。陳清華等[10]曾用過氧化物酶和酯酶同工酶來鑒定二倍體 （2X）、三倍體（3X）、四倍體（4X）西瓜。結(jié)果表明，四倍體的酯酶活性要比二倍體低；而無籽西瓜組合母本的譜帶與F1差異較明顯。

5 雜交鑒定法

研究者在西瓜中利用反交法，以待鑒定的誘導(dǎo)植株為母本、已知二倍體植株為父本進(jìn)行套袋隔離雜交，單瓜留種。若所結(jié)種子為具有種胚的正常種子，說明被鑒定株是未變異的二倍體植株。若所結(jié)種子為不具種胚的空殼種子，說明被鑒定植株是發(fā)生變異的四倍體植株。

綜上可見，多倍體鑒定方法有多樣性，而各種方法優(yōu)缺點(diǎn)不一。利用形態(tài)學(xué)性狀來鑒定倍性的優(yōu)點(diǎn)是簡便快速，且實(shí)用性強(qiáng)，較易掌握該測(cè)定方法，準(zhǔn)確率也較高，不足之處是經(jīng)驗(yàn)因素過多，可能會(huì)因人而異。而染色體鑒定法、同工酶鑒定法簡便、快速、準(zhǔn)確，但缺點(diǎn)是技術(shù)難度大。而條件鑒定法、雜交鑒定法需耗費(fèi)更多的時(shí)間和勞力，實(shí)際研究中應(yīng)用較少。因此，在多倍體研究中，要針對(duì)不同作物的特點(diǎn)綜合考慮，多管齊下，才可能準(zhǔn)確鑒定選擇出多倍體。

[1]張旺凡，汪友蓉.多倍體育種技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域應(yīng)用進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，12（2）：83 ～ 85.

[2]胡玉林，謝江輝，郭啟高，等.秋水仙素誘導(dǎo) GCTCV-119香蕉多倍體[J].果樹學(xué)報(bào)，2006，23（3）：462 ～ 464.

[4]韓毅科，杜勝利，王鳴.黃瓜染色體制片及倍性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003，18（1）：72 ～ 74.

[5]雷春，陳勁楓，張曉青，等.不同倍性黃瓜的形態(tài)和一些生理生化指標(biāo)比較[J].植物生理學(xué)通訊，2005，41（4）：471 ～ 474.

[6]王小華，熊麗，屈云慧.中國桔梗多倍體誘導(dǎo)與鑒定[J].云南植物研究，2006，28（6）：593 ～ 598.

[7]鄭思鄉(xiāng)，胡秀，雷小云，等.離體培養(yǎng)條件下三色堇多倍體誘導(dǎo)研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18（4）：397 ～ 400.

[8]劉文革，閻志紅，饒小莉.不同倍性西瓜的葉表皮微形態(tài)特征比較[J].果樹學(xué)報(bào) 2005，22（1）：31 ～ 34.

[9]郭啟高，宋明，楊天秀，等.西瓜試管苗中四倍體鑒定方法研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（3）：261 ～ 263.

[10]陳清華，彭慶務(wù)，黃濤，等.西瓜過氧化物酶、酯酶同工酶酶譜及其利用研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998（2）：22 ～ 24.