治療急性缺血性腦中風神經(jīng)保護藥物研發(fā)的進展和展望

戴甲培，馮 斌

(1中南民族大學武漢神經(jīng)科學與神經(jīng)工程研究所，武漢430074;2中南民族大學藥學院，武漢430074;3中南民族大學生命科學學院，武漢430074)

腦中風是世界死亡率排名第二的疾病，每年死于腦中風的大約為600萬人.據(jù)估計，人一生中患腦中風的概率為8% ～10%［1］.腦中風一般可分為缺血性腦中風(占所有腦中風的85%)和出血性腦中風(占所有腦中風的15%)［2］.缺血性腦中風的定義是血流減少導致正常細胞的功能改變.大腦組織對局部缺血非常敏感，即使神經(jīng)元的短時間缺血也會引發(fā)一系列的事件，最終導致細胞的死亡.腦組織的損傷通常是由于缺血和血液再灌注引起的復雜聯(lián)級反應的綜合結果.

本文主要從缺血性腦中風的病理生理學機制，治療藥物的研發(fā)策略，特別是神經(jīng)保護藥物研究存在的主要問題等方面進行綜述和分析.

1 急性缺血性腦中風的病理機制和神經(jīng)保護藥物的研發(fā)

腦中風的病理生理包含許多過程:如能量耗散，細胞內離子失衡，酸中毒，胞內鈣離子增加，興奮性神經(jīng)遞質的毒性作用，自由基介導的細胞毒性，花生四烯酸產(chǎn)生，細胞因子介導的細胞毒性，補體激活，血腦屏障被破壞，神經(jīng)膠質細胞被激活和白細胞滲透等，這些相互關聯(lián)的事件在缺血的區(qū)域會導致腦組織壞死.腦部缺血幾分鐘后，缺血部位的腦組織血流急劇減少并造成不可逆的傷害，從而導致細胞死亡.壞死的組織被一些受損傷較小的相鄰組織包圍著，這些組織由于血流的減少而導致功能的沉默，但依然有代謝活性［3，4］.壞死是細胞形態(tài)上的變化，包括最初的細胞和細胞器的腫脹，接下來的細胞核、細胞器和質膜崩解，最后細胞內容物流出胞外［3，4］.在缺血早期階段，缺血半影區(qū)占損傷全部體積的一半，這個區(qū)域為腦中風后的治療提供了一個靶向區(qū)域［5］.輕度的局部腦缺血，發(fā)展比較緩慢，可以激活相關的基因而導致最終的細胞凋亡［6-8］.最近的研究表明，許多缺血區(qū)的神經(jīng)元的細胞凋亡過程要數(shù)小時到數(shù)天時間，因此它們在腦中風發(fā)生后仍然有恢復的可能.與細胞壞死相比，細胞凋亡是一個程序化的和耗能的細胞死亡過程.細胞凋亡是有組織有步驟的分解細胞，并且對周圍的細胞的傷害和干擾最?。?］.一般有內部和外部兩種激活細胞凋亡的途徑.在過去的10年中，實驗研究對缺血性腦中風后細胞凋亡過程有了新的認識.

1.1 鈣失調和鈣穩(wěn)定劑

細胞缺血性死亡級聯(lián)反應部分由谷氨酸受體和電壓門控鈣離子通道(VDCC)激活導致過量的鈣流入所介導.另外，Ca2+-ATP酶失效，導致細胞內鈣濃度持續(xù)增高.阻斷谷氨酸受體的藥物(如MK-801)和阻斷VDCC的藥物(如尼莫地平、氟桂嗪)在嚙齒動物中風模型中具有治療效果［9］.最近的利阿諾定受體(ryanodine receptors)抑制劑丹曲洛林(dantrolene)在嚙齒動物模型中表現(xiàn)出較好的實驗結果，并且開始討論進行臨床實驗［10］.

1.2 谷氨酸興奮毒性和抑制興奮毒性的藥物

谷氨酸是腦內的一種主要的興奮性遞質，它在缺血后積累在細胞外，并且激活各種受體［11］.谷氨酸受體的激活引起細胞內離子濃度的改變，主要是鈣離子和鈉離子.實驗研究表明，谷氨酸的毒性作用主要是由于鈣離子的內流引起的［12，13］.此外，細胞內鈉離子濃度太高在缺血的開始階段會危害神經(jīng)元的存活［14］.

許多抑制谷氨酸受體活化的化合物被用于中風的動物模型實驗和人類臨床實驗.非競爭性的NMDA受體拮抗劑MK-801(地佐環(huán)平)在實驗動物模型中減少 75% 的缺血體積［15，16］.MK-801 和右美沙芬(dextromorphan，另外一個非競爭性 NMDA受體拮抗劑)在動物模型中也表現(xiàn)良好保護作用，但在臨床實驗中卻因有精神副作用和治療效果不明顯而在早期階段終止［17］.另外一些非競爭性的(如阿替加奈，純地蠟)或競爭性的(如塞福太，依利羅地)的NMDA受體拮抗劑在中風的動物模型有很好的效果，但在臨床實驗中也沒有顯著的治療效果［18］.不論怎樣，基于抑制谷氨酸興奮性治療腦中風的方法還是有一定前景的.例如，最近的研究發(fā)現(xiàn)突觸后致密物(PSD-95)抑制劑在靈長類動物腦中風治療中取得了很好的效果［19］.

1.3 細胞凋亡和抑制劑

腦中風損傷中細胞的凋亡最終導致了神經(jīng)元的死亡.神經(jīng)元凋亡中關鍵性的酶是半胱天冬酶［20］.半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族中的一員，該家族至少有14個成員，并且可以分為三組(I、II和III).許多科研團體研究廣譜型半胱天冬酶抑制劑z-VAD治療缺血性中風引起的神經(jīng)退行性癥狀的效果.半胱天冬酶第I組中的Ac-YVAD-cmk(Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-cmk)在短暫腦缺血性中風模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用［21］.另外，多肽形式的半胱天冬酶抑制劑在腦中風動物模型中能夠減少神經(jīng)元的丟失［22］.不過直到目前為止，細胞凋亡抑制劑還沒有進行相關臨床試驗.

1.4 氧化應激、脂質過氧化作用和抗氧化劑

不斷增加的研究證據(jù)表明，在缺血腦中風的病理生理過程中，氧化應激和細胞凋亡是緊密聯(lián)系的現(xiàn)象.許多實驗和臨床觀察表明，不同形式的腦中風自由基的產(chǎn)生都增多［23，24］.腦中風過程產(chǎn)生的自由基包括過氧化物陰離子、氫氧根(OH－)和一氧化氮(NO).自由基一個主要的來源是線粒體，在電子傳遞鏈中產(chǎn)生過氧化陰離子［24］;另外一個重要的來源是通過環(huán)氧合酶和脂肪氧化酶代謝花生四烯酸產(chǎn)生的過氧化物［25，26］.氧化自由基也可以由小膠質細胞的激活產(chǎn)生，并能在缺血組織再灌注的過程中滲透到周圍的白細胞中［27］.這個氧化反應引起進一步的組織損傷，并且被認為是缺血性腦中風后細胞凋亡的一個重要的觸發(fā)分子.

NO合成酶作用于L-精氨酸生成NO.NO合成酶在一部分神經(jīng)元中表達，它的合成需要激活鈣調蛋白［28］.可誘導的NO合成酶由小膠質細胞和單核細胞等炎癥細胞表達.這兩種不同來源的NO合成酶在缺血的情況下都會對腦組織產(chǎn)生損害作用.另一種NO合成酶來自內皮細胞，它有擴張血管的作用，并且對促進局部血流是有益的［29］.NMDA受體的激活可以刺激NO合成酶生成NO，這個過程可能在缺血性腦中風由興奮性氨基酸介導的腦損傷中起到了一定的作用［30］.NO可以在細胞膜中自由擴散，并可與過氧化物反應產(chǎn)生另外一種具有高反應性的過氧亞硝基(ONOO-)［31］.氧化產(chǎn)生的自由基和具有活性的氮化物在腦中風后會激活諸如細胞凋亡、炎癥之類的過程導致細胞死亡［32-34］.

脂質過氧化作用在腦中風的發(fā)病機理中扮演一個重要的角色.細胞膜脂質過氧化作用引起神經(jīng)元凋亡的機制包括產(chǎn)生4-hydroxynonenal(4-HNE)，4-HNE能造成Na+/K+、葡萄糖和谷氨酸等細胞膜轉運體的損傷［35］.鈣離子和自由基在導致?lián)p傷的同時，也激活神經(jīng)保護的轉錄因子，包括NF-κB、低氧誘導因子-1和干擾素調節(jié)因子-1［6］.有些轉錄因子能誘導細胞炎癥因子(如IL-1、IL-6和TNF-α)、趨化因子(如 IL-8和 MCP-1)、內皮細胞粘附分子(如selectins、ICAM-1和VCAM-1)和其他促炎癥基因的表達［6，36］.此外，氧的供應減少會通過無氧酵解過程導致乳酸的積累，最終引起酸中毒［37-40］，酸中毒也干擾細胞內蛋白質的生成.

這些自由基導致的損傷可以被抗過氧化酶和自由基清除劑降低［41，42］.很多阻止自由基產(chǎn)生和抑制自由基活性的藥物在中風動物模型中表現(xiàn)良好的治療效果.尿酸是組織和體液中天然的抗氧化劑.注射尿酸能夠顯著減少缺血性損傷和改善動物行為［43］.依達拉奉(edaravone)，四甲吡嗪(tetramethylpyrazine)，PBN(alpha-phenyl-N-tertbutyl-nitrone)，F(xiàn)R210575，NXY-59 等一些其他的自由基抑制劑在治療腦中風損傷的動物實驗中表現(xiàn)出很好的效果［44，45］.但在已經(jīng)完成的臨床試驗中，自由基清除劑只有很有限的治療效果.NXY-59最早被報道在急性缺血性中風中有效果［46］，但在較大的人群試驗中卻沒有表現(xiàn)出很好的效果［47］.伊普森(Ipsen)研發(fā)的EGb-761(Tanakan?)是從銀杏樹中提取的自由基清除劑［48］，最近已經(jīng)完成臨床3期試驗，其治療效果依然不能十分肯定.

1.5 炎癥和抗炎癥藥物

腦中風引起的炎癥特征主要是腦內白細胞的積累和小膠質細胞的激活.大量實驗證據(jù)表明白細胞在腦中風的發(fā)病機理中起到一定的作用.白血球調節(jié)再灌注誘導的組織損傷和微血管障礙有3個主要的證據(jù):(1)白血球在缺血后的組織中積累;(2)缺血性腦中風對有中性白細胞減少癥的實驗鼠損傷較小;(3)用單克隆抗體阻斷白細胞-內皮細胞的附著性可減少缺血性腦中風的損傷［37］.因此中性粒細胞與中風有著緊密的聯(lián)系.在急性腦缺血后中性白細胞附著在血管內皮并且滲透到大腦軟組織［49-52］.用抗中性白細胞血清處理的大鼠的大腦中風后梗塞面積減少，同樣表明嗜中性白血球的積累在中風的病理過程中起著重要的作用［53，54］.相比較而言，中風后淋巴細胞在腦中的集聚的病理顯著性并不十分明顯.此外，最近有研究表明T-淋巴細胞在調節(jié)缺血性腦中風后的再灌注損傷中有重要的作用［55，56］.然而，淋巴細胞和嗜中性白血球在中風病理生理過程中的相互作用機理還不是十分明確.

大腦中有許多細胞在缺血損傷后會分泌促炎癥的調節(jié)因子，它們包括內皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和神經(jīng)元.在缺血后的腦組織中轉錄因子的激活導致細胞內蛋白質水平的升高和內皮細胞粘附分子的表達升高［57-59］.在大腦中引起炎癥的主要是小膠質細胞，在中風后的半影區(qū)中更是如此［60］.小膠質細胞激活后會產(chǎn)生促炎癥的細胞因子以及有毒性的代謝物和酶類［58，61］.除了小膠質細胞之外，星形膠質細胞在中風誘導的炎癥中也扮演重要的作用.這些細胞能同時產(chǎn)生促炎癥因子和神經(jīng)保護因子，例如:促紅細胞生長素，轉化生長因子-β1(TGFβ1)和 Metallothionein-2 等［62］.小膠質細胞和星形膠質細胞產(chǎn)物具有損傷因子和保護因子的雙重特性，總的效果在腦中風不同時間點所起的作用不同，一般在缺血損傷數(shù)天至數(shù)周后保護和恢復作用開始出現(xiàn)［60，63］.這些因素會增加研究腦中風的病理生理學和尋找新的治療方法的困難.

炎癥還參與腦中風再灌注之后血管內聚集物形成［55，49］，這與細胞粘著分子產(chǎn)生有重要的關系，如選擇蛋白、整合蛋白和細胞間黏附分子(ICAM)允許內皮的炎癥細胞相互作用.用選擇蛋白抗體治療小鼠暫時局部腦缺血性中風使梗塞體積減少70%［64］.抗ICAM-1抗體也能減少梗塞體積，不過只對短暫局部腦缺血性中風有效果，而對永久性局部腦缺血中風沒有效果［65］.然而，最近的臨床試驗用鼠科動物的抗ICAM-1抗體恩莫單抗(enlimomab)增加了神經(jīng)功能損傷評分和病人的死亡率，后續(xù)的研究在老鼠模型上用抗ICAM-1抗體同樣發(fā)現(xiàn)梗塞面積的增大并且對中風無治療效果［66，67］.研究者認為對外源大鼠蛋白的免疫激活反應可能最終導致了臨床試驗的失敗和后面的動物模型實驗結果無效［67］.最近，抗 CD11b/CD18 試劑 UK-279276 已完成臨床2期試驗，表明這個化合物是安全的并且耐受性良好［68］.其他靶點包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，它與炎癥細胞分子產(chǎn)生和缺血性中風損傷中的細胞死亡有關.SB239063是MAPK抑制劑，它能減少嚙齒動物中風模型中的梗塞體積并且改善動物行為.MAPK可以作為治療中風的替代靶點［69］.

1.6 血腦屏障障礙和其它因素

腦中風后，血腦屏障會增加通透性和降低屏障功能，并且像其他器官中的缺血損傷一樣，血管壁基底層會逐漸剝落［70］.大量的證據(jù)表明急性缺血性腦中風會增強腦血管內皮細胞和血管外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的相互作用，也會增強腦血管內皮細胞和血管內細胞的相互作用，而這些作用進而引發(fā)損傷過程［36］.最后產(chǎn)生的結果表現(xiàn)為:(1)毛細血管的低通透性;(2)增強血管內細胞的粘附性;(3)促進炎癥的發(fā)生;(4)促進血栓的形成;(5)降低內皮細胞的屏障功能.這些都是快速而有效治療需要面對的問題.

另外，實驗研究表明缺血性腦中風損傷中存在著一些異常的機制.一種新的中樞神經(jīng)蛋白Pancortin-2與肌動調節(jié)蛋白、Wiskott-Aldrich綜合癥蛋白verprolin homologous-1(WAVE1)以及Bcl-xL共同形成線粒體相關的蛋白質復合體，該復合體能夠減少成人中局部腦缺血損傷的細胞凋亡［71］.

中樞系統(tǒng)神經(jīng)元表現(xiàn)一些Toll樣受體(TLRs)，缺血性腦中風后TLR激活jun-N-terminal kinase(JNK)的促凋亡信號和 AP-1 轉錄調節(jié)因子［72，73］.其他在缺血性腦中風中激活的新型受體包括Notch和 Adiponectin 受體［74，75］.在局部腦缺血性中風中 γ-分泌酶和脂聯(lián)素(adiponectin)通過它們的細胞表面受體調節(jié)信號(分別是NOTCH-1和ADR-1)惡化神經(jīng)元凋亡［74，76］.

總之，這些結果表明有許多的通路影響中風所導致的后果，對應的就有許多潛在的治療中風的靶點.

2 目前的治療方法和藥物研究存在的問題

把動物實驗結果轉為臨床應用的基本問題是動物模型中的病理生理過程是否與人類疾病有關聯(lián).可能出現(xiàn)的問題是動物模型和人類疾病在解剖學和生理學上的差異，以及損傷的病理生理學差異.所有這些問題都是相互關聯(lián)的.通常在損傷之前或損傷之后立即實施治療會得到好的效果.動物模型實驗開始之前通常要制定一個實驗計劃，設計藥物實驗的整個過程.如果治療可行，就要從損傷開始時設置不同的治療時間間隔模擬臨床治療.在動物模型中，最佳的治療時間(時間窗)是在中風后的15～30 min之內，在損傷3h以后基本上無效.中風之后減少缺血體積最重要的步驟是血管的再通.血管再通可以自然發(fā)生，但一般用溶栓藥物使其再通.然而，這個過程也可能導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再灌注損傷，使臨床治療更加困難.因此，需要關心的不僅僅是縮短從損傷到治療的時間，也要認識到潛在的其他的病理機制，這些病理機制可能給中風之后帶來嚴重的后果.

3 研發(fā)治療缺血性中風藥物的新趨勢

缺血性中風導致的腦部組織的損傷是由于各種因素的相互作用而產(chǎn)生，如興奮性毒性，氧化應激，炎癥和細胞凋亡.如上所述，20年的基礎研究針對單一中風損傷機制或一種細胞類型獲得的研究并應用這些結果進行臨床實驗都導致失敗.腦缺血性中風的復雜機制和針對單一靶點的臨床試驗告訴我們，單一靶點的神經(jīng)保護劑治療腦中風不能取得很好的治療效果.不斷的研究表明，治療腦中風要一種多效性的方法，能作用于不同的細胞類型和不同的病理機制.中藥的多效性和多靶點作用可能是一種治療中風的選擇，孫衍鯤研究了天麻提取物［77］、李秀芳研究了川穹揮發(fā)油［78］對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，都取得了一定的成果.但由于其藥物作用機制復雜，有待進一步研究和開發(fā).

另外，盡管在動物模型中許多的藥物都能阻斷導致神經(jīng)元缺血性死亡的級聯(lián)反應，但是在人腦中風中卻沒有發(fā)現(xiàn)到有良好效果神經(jīng)保護的藥物.這種在動物模型和臨床試驗中存在的不一致性可能是由于以下的一些因素:人腦中風的異質性，人和動物腦部形態(tài)和功能的區(qū)別，中風后臨床試驗注射藥物的時間相對較晚，在動物實驗中實驗條件能得到更好的控制(如溫度，血壓等).針對人腦中風異質性的問題，可以用與人更接近的靈長類動物來進行藥物有效性評估，最近的一項研究在這方面取得了重要的進展［19］.

4 結語

缺血性腦中風導致的腦組織損傷是由于多種復雜的病理過程之間的相互作用.中風損傷的分子生物學是一個快速的發(fā)展的研究領域，在發(fā)展的過程中不斷發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和直接的治療方法.大量針對不同通路的藥物正在被開發(fā).然而，盡管在動物模型中許多的藥物都能阻斷導致神經(jīng)元缺血性死亡的級聯(lián)反應，但是在人腦中風中卻沒有發(fā)現(xiàn)到具有良好效果的神經(jīng)保護性藥物.因而，把動物模型獲得的研究結果轉換到臨床試驗研究仍然有許多重要的問題沒有解決.

我們認為需要一種開發(fā)治療腦中風神經(jīng)保護作用藥物的新模式.它能針對中風損傷的多個信號通路和不同細胞類型，而不是已經(jīng)被臨床證明不可行的只針對單一信號通路和一種神經(jīng)元類型.我們稱之為腦中風的多靶點治療.開發(fā)新的針對多靶點的藥物是未來發(fā)展的趨勢.

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