Dickkopf-1對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值及其研究進(jìn)展

池肇春

中國(guó)海洋大學(xué)青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)科 (山東青島，266071)

2012年我國(guó) Shen等［1］首次報(bào)告 Dickkopf-1(DKK-1)可與AFP互補(bǔ)提高肝細(xì)胞癌 (HCC)診斷率，引起了廣泛的反響。DKK-1是從非洲蟾蜍中編碼的一種分泌蛋白，由259個(gè)氨基酸組成，分子量40000的基因，該蛋白誘導(dǎo)胚胎的頭部區(qū)，是胚胎時(shí)期頭部形成的誘導(dǎo)子和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制因子。以后發(fā)現(xiàn)許多動(dòng)物和人也表達(dá)DKK-1。其與Wnt傳導(dǎo)通路有關(guān)。但詳細(xì)機(jī)理尚不十分清楚。Wnt是一個(gè)原癌基因家族，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路除DKK-1外，還被許多細(xì)胞外蛋白分子調(diào)節(jié)，包括 Fr2B/FRP、WIFI、Cerberus等。DKK-1除與腫瘤相關(guān)外，與許多疾病如骨疾病、藥物代謝、神經(jīng)退行性疾病、皮膚病、動(dòng)脈硬化、腎病等均有復(fù)雜的相關(guān)性。本文僅就DKK-1與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性、作用機(jī)理與研究進(jìn)展作一評(píng)述。

1 DKK-1與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性及其作用機(jī)理［1～4］

DKK-1轉(zhuǎn)錄和血清蛋白上調(diào)，血清和組織DKK-1水平增高在肝細(xì)胞癌的遷移、侵襲和腫瘤生長(zhǎng)上發(fā)揮功能作用。DKKs是一組分泌型糖蛋白，包含DKK-1～4四個(gè)成員。DKKs有一個(gè)信號(hào)序列和兩個(gè)富含半胱氨酸的保守區(qū)，分別為靠近N端的CYS1和靠近C端的CYS2。人DKK-1由266氨基酸組成，其相對(duì)分子量在29kD左右，而糖基化形式的DKK-1在WesternWnt分子雜交檢測(cè)顯示位于35kD位置。Tulact等報(bào)道Western分子雜交有時(shí)可檢測(cè)到DKK-1不同的糖基化水平面的條帶。對(duì)DKKs功能域和DKKs嵌合體的研究顯示，Wnt8抑制需要DKK-1和DDK-2的C端與LRP6R的相互作用，而DKK-1的N端部分能對(duì)DKK-1和LRP5/6的相互作用起抑制作用。DKK-1是Wnt通路的抑制因子。分泌蛋白Wnt結(jié)合細(xì)胞表面受體Frizzed，通過(guò)β-catenin(β-連環(huán)蛋白)的降解復(fù)合體解散阻斷β-catenin降解途徑，促使β-catenin進(jìn)入胞核與TCF(T細(xì)胞因子)結(jié)合，啟動(dòng)多種靶基因表達(dá) (有細(xì)胞特異性)，其中的c-Myc、cyclin D、Akt等與細(xì)胞周期的調(diào)控與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，除此之外Wnt發(fā)生作用還需要另一個(gè)受體LRP5/6，而DKK-1能與通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體的LRP5/6、kremen1/2在Wnt通路中起負(fù)調(diào)控作用。DKK-1表達(dá)受p53、MYCN、β-catenin等基因調(diào)控，DKK-1在細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，但有時(shí)能在促凋亡因子存在時(shí)誘發(fā)凋亡。DKK-1在一些腫瘤中低表達(dá)，而在另一些腫瘤中高表達(dá)。DKK-1在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移這幾個(gè)階段中的表達(dá)和功能表現(xiàn)出復(fù)雜多重的差異。間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)在DKK-1起關(guān)鍵作用。MSCs通過(guò)DKK-1和c-Myc，在肝細(xì)胞增殖上發(fā)揮作用，而SOX2核心轉(zhuǎn)錄因子，在全能的維持上發(fā)揮重要作用。新近報(bào)告SOX2也在成人干細(xì)胞 (ASCs)中表達(dá)，但SOX2在ASCs上的作用仍不明了。SOX2又稱(chēng)SRY相關(guān)HMG盒基因2，是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，是SOX基因家族 (分SOX1，2，3)的一個(gè)成員，在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵性作用。ASCs型抑制研究顯示，SOX2抑制結(jié)果有細(xì)胞生長(zhǎng)和毛細(xì)血管發(fā)育改變，同時(shí)有DKK-1表達(dá)降低。染色體免疫力沉淀和蟲(chóng)熒光素測(cè)定提示，SOX2與DKK-1結(jié)合且在轉(zhuǎn)錄上有正性調(diào)節(jié)作用。DKK-1表達(dá)在SOX2抑制hMSCs分化畸形，但可能不取消增殖缺陷。細(xì)胞增殖受c-Myc調(diào)節(jié)，而表達(dá)也可能被SOX2調(diào)控。c-Myc是Myc基因家族的主要成員之一，是一種易位基因和多種形式物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)節(jié)基因，也是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖使之獲得永生特殊化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，也是一種癌基因，與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。SOX2直接調(diào)節(jié)DKK-1表達(dá)。Park等［5］指出，SOX2直接調(diào)節(jié)DKK-1表達(dá)，其后果是決定hMSCs分化。SOX2調(diào)節(jié)也受c-Myc影響而增殖。結(jié)果提示SOX2可能有一種特殊功能，通過(guò)調(diào)節(jié)DKK-1和c-Myc控制ASCs的生長(zhǎng)和分化。

MSCs抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Zhu等證實(shí)DKK-1被MSCs表達(dá)是受 NANOG調(diào)節(jié)。NANOG于2003年被發(fā)現(xiàn)，屬于ANTP類(lèi)，NK基因家族，NANOG基因?qū)偻春谢?，是胚胎干?xì)胞自我更新所必需的基因，NANOG缺失導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞 (ES)分化，在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。該因子可維持ES自我更新及全能性，對(duì)癌細(xì)胞增殖有抑制作用。

Kim等［6］發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶9(CA9)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移和侵蝕，而DKK-1像是一個(gè)新的CA9相互作用蛋白。在試管內(nèi)發(fā)現(xiàn)CA9 N末端域參與DKK-1的纈氨酸-酪氨酸作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生上DKK-1抑制CA9的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，而且抑制由CA9介導(dǎo)引起的mTOR(一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶)磷酸化，提出DKK-1在腫瘤生成上的一個(gè)新作用。

Wnt本身是原癌基因，當(dāng)突變時(shí)可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，當(dāng)突變或過(guò)表達(dá)引起腫瘤形成，p53是抑癌基因，當(dāng)p53功能喪失可加速Wnt引起腫瘤的發(fā)生。Wang等［7］發(fā)現(xiàn)DKK-1是被野生型p53引起，結(jié)果指出，p53介導(dǎo)DKK-1拮抗Wnt信號(hào)途徑。

如上所述DKK-1的表達(dá)受p53調(diào)節(jié)。將攜帶p53基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體 (Adp53)導(dǎo)入到p53缺失的人的瘤細(xì)胞株Hep3B中，以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)p53對(duì)DKK-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明DKK-1 RNA在轉(zhuǎn)錄p5320小時(shí)后即有明顯增加，其中32小時(shí)達(dá)最高水平。提示p53能調(diào)節(jié)Wnt通路抑制因子DKK-1的mRNA表達(dá)。

2 DKK-1對(duì)HCC的診斷價(jià)值與臨床應(yīng)用

近年的研究顯示，HCC患者血清DKK-1水平增高，可作為血清標(biāo)記用于HCC診斷，還具有監(jiān)測(cè)HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清DKK-1水平與HCC患者腫瘤直徑、Edmondson-steiner分級(jí)及靜脈浸潤(rùn)等密切相關(guān)。2012年我國(guó)Shen等［1］在柳葉刀腫瘤雜志發(fā)表DKK-1的研究報(bào)告，作者通過(guò)設(shè)立HCC、慢性HBV感染、肝硬化和健康對(duì)照組，用ELISA測(cè)定血清DKK-1，用ROC(接收機(jī)操作特征)計(jì)算診斷準(zhǔn)確性，對(duì)831份血清標(biāo)本 (試驗(yàn)組)進(jìn)行評(píng)估。其中HCC 424例，慢性HBV感染98例，肝硬化96例和健康對(duì)照組213例;驗(yàn)證組453份:HCC 209例，慢性HBV感染73例，肝硬化72例和健康對(duì)照組99例。結(jié)果HCC血清DKK-1比對(duì)照組有顯著增高。ROC曲線提示最佳診斷值為2.153ng/ml，試驗(yàn)組敏感性和特異性分別為69.1%和90.6%;驗(yàn)證組分別為71.3%和87.2%。對(duì)HCC AFP陰性患者可達(dá)到精確診斷，試驗(yàn)組敏感性和特異性分別為70.4%和90.5%;驗(yàn)證組分別為66.7%%和87.2%。HCC患者DKK-1血清濃度升高可與慢性HBV感染、肝硬化鑒別，若DKK-1和AFP聯(lián)合測(cè)定可進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確率。DKK-1在HCC診斷上補(bǔ)充AFP測(cè)定的不足，改善AFP陰性HCC患者的確診率，有助于HCC與非惡性慢性肝病的鑒別。

Qin 等［8］研究 DDK-1 和 Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑在HCC細(xì)胞增殖和遷移上的作用。cDNA芯片提示，24基因與腫瘤H7402和M-H7402細(xì)胞之間不同的表達(dá)有關(guān)。Western分子雜交分析有β-連環(huán)蛋白、c-Myc和周期素D1表達(dá)上調(diào)，但在M-H7402細(xì)胞DKK-1和nm23基因是戲劇性下調(diào)，提示兩種細(xì)胞系在伴有轉(zhuǎn)移的分子事件上有顯著不同。目前已知人類(lèi)的nm23基因主要有8型，其中主要是 nm23-H1和nm23-H2，這兩個(gè)亞型定位在人類(lèi)17號(hào)染色體上，緊靠p53位點(diǎn)，被認(rèn)為是許多腫瘤形成的基因定位，并且是容易發(fā)生等位基因雜合性缺失的熱點(diǎn)區(qū)域。DKK-1過(guò)度表達(dá)被轉(zhuǎn)染可有力地下調(diào)c-Myc和周期素D1的表達(dá)，同時(shí)也抑制M-H7402的生長(zhǎng)和遷移，在H7402細(xì)胞被核糖核酸干擾時(shí)，DKK-1表達(dá)減少，但也有能力使β-連環(huán)蛋白、c-Myc和周期素D1的表達(dá)上調(diào)，也啟動(dòng)β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)位從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，并增加細(xì)胞的遷移。結(jié)論是DKK-1/Wnt/β-連環(huán)蛋白級(jí)聯(lián)在轉(zhuǎn)移過(guò)程介導(dǎo)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

到目前為止DKK-1在肝細(xì)胞癌上有3方面的應(yīng)用:①診斷標(biāo)記:血清DKK-1測(cè)定，對(duì)肝細(xì)胞的診斷其敏感性和特異性高，尤其對(duì)AFP陰性的患者也可作出診斷，如果與AFP聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷率;由于其他腫瘤和其他疾病如骨疾病、一些炎癥、神經(jīng)退行性疾病等鑒別也可表達(dá)增高，故診斷時(shí)應(yīng)認(rèn)真做好鑒別;②鑒別診斷:AFP＞20ng/ml時(shí)可與慢性乙型肝炎和肝硬化鑒別;③預(yù)后判斷指標(biāo):放化療、手術(shù)治療或其他保守治療后動(dòng)態(tài)觀察DKK-1的變化，有助于判定療效、了解有無(wú)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可作為評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)。

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